楊奇盛 趙 剡 周賢龍 倪紹洲 沈 俊 王 翔 潘正啟 宋小兵

武漢大學中南醫(yī)院急救中心（武漢 430071）

大鼠睪丸扭轉/復位引發(fā)CCDD44++TT細胞亞群失衡對生殖細胞凋亡的影響*

楊奇盛 趙 剡 周賢龍 倪紹洲 沈 俊 王 翔 潘正啟 宋小兵

武漢大學中南醫(yī)院急救中心（武漢 430071）

目的探討在大鼠睪丸扭轉/復位過程中CD4+T細胞亞群Th1/Th2失衡對生殖細胞凋亡的影響。方法SD雄性成年大鼠30只，隨機分成假手術組、睪丸扭轉組和復位組，每組10只。通過建立左側睪丸扭轉和扭轉復位動物模型，在手術后24h分別取材，血清酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測血清干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素12（IL-12）、白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素10（IL-10）水平；原位缺口末端標記法（TUNEL法）檢測各組左側睪丸生殖細胞凋亡指數(shù)。結果與假手術組相比，扭轉組和扭轉復位組與Th1細胞相關的細胞因子IFN-γ、IL-12水平升高明顯（P＜0.05），Th2細胞相關的細胞因子IL-4和IL-10水平下降（P＜0.05）；生殖細胞凋亡指數(shù)增加。結論在大鼠睪丸扭轉和復位過程中CD4+T細胞亞群偏移與生殖細胞凋亡存在相關性。

T淋巴細胞亞群; 精索扭轉; 再灌注損傷; 細胞凋亡

Key woorrddssT-Lymphocyte Subsets; Spermatic Cord torsion; reperfusion injury; Apoptosis

睪丸扭轉是臨床常見的急癥，多發(fā)生于25歲前的青少年，必須緊急外科手術復位恢復睪丸血供[1]。在睪丸扭轉及復位過程中缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理生理現(xiàn)象，是多因素參與的復雜病理過程，涉及到多個環(huán)節(jié)，其中免疫反應是造成睪丸生精功能損害作用機制之一。CD4+T淋巴細胞是機體主要免疫調節(jié)細胞，主要有Th1和Th2兩種亞群[2]。本研究通過建立大鼠睪丸扭轉/復位動物模型，檢測血漿CD4+T細胞亞群相關因子變化及睪丸組織生殖細胞凋亡，探討CD4+T細胞亞群失衡變化趨勢。

材料和方法

一、實驗動物分組及動物模型的制作

健康成年SD雄性大鼠（SPF級，購自武漢大學醫(yī)學院動物實驗中心）30只，隨機分為假手術組（A組）、睪丸扭轉組（B組）和復位組（C組），每組10只。

睪丸扭轉動物模型建立方法[3]：乙醚吸入麻醉，常規(guī)消毒，下腹部正中小切口，顯露左側睪丸并切斷睪丸引帶，分離筋膜至附睪頭，順時針旋轉左側睪丸720°固定于腹壁并縫合傷口。睪丸扭轉復位動物模型建立方法：順時針旋轉左側睪丸720°并維持2h期間夾閉傷口，2h后將扭轉睪丸復位固定于陰囊。

A組SD大鼠乙醚吸入麻醉后，下腹部正中小切口，顯露左側睪丸后縫合，術后飼養(yǎng)24h取材；B組左側睪丸扭轉，術后飼養(yǎng)24h取材；C組左側睪丸扭轉后復位，術后飼養(yǎng)24h取材。

二、實驗方法

（一）血清酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測

各組大鼠抽取頸靜脈血液，室溫靜置2h，3000r/ min離心15min后取上清，-20℃保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測各組血漿中干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素12（IL-12）、白細胞介素4（IL-4）、白細胞介素10（IL-10）的濃度（按試劑盒說明書操作）。

（二）睪丸生殖細胞凋亡檢測

取各組大鼠左側睪丸組織，4%多聚甲醛固定睪丸組織后制作石蠟切片，檢測生殖細胞凋亡。采用原位缺口末端標記法（TUNEL法）檢測睪丸生殖細胞凋亡情況。凋亡細胞核呈棕黃色，陰性對照不加末端轉化酶。凋亡指數(shù)（AI）計算：每張切片隨機選取100個生精小管橫切面(×400），計數(shù)凋亡細胞，求得平均每生精小管橫切面凋亡細胞數(shù)。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、EELLIISSAA檢測結果

各組ELISA檢測結果中，CD4+T細胞亞型Th1分泌的細胞因子IFN-γB組和C組分別與假A組比較，血清濃度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中C組較B組升高明顯（P＜0.05）。與促Th1細胞分泌細胞因子IFN-γ相關的IL-12在B組和C組血漿中均升高，與A組比較升高差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中C組較B組升高明顯（P＜0.05），其變化與IFN-γ呈正相關。Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-10在B組和C組血清濃度均較A組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中IL-10在C組血清濃度與B組血清濃度比較降低明顯。然而IL-4在B組血清濃度高于C組血清濃度（P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠血清檢測結果及扭轉睪丸組織凋亡指數(shù)比較

二、生殖細胞凋亡檢測

各組均取左側睪丸組織行TUNLE檢測，發(fā)生凋亡的細胞核被染成棕黃色。A組凋亡細胞較少，B組和C組左側睪丸組織凋亡生殖細胞明顯增多。B組和C組生殖細胞凋亡指數(shù)顯著高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

圖1 各組大鼠左側睪丸生殖細胞凋亡程度比較

討 論

睪丸扭轉造成睪丸組織缺血，對睪丸生精上皮及間質均造成不同程度的損害，導致睪丸生殖細胞凋亡，同時全身或睪丸局部在抗原遞呈細胞（antigen presenting cells）輔助作用下使淋巴細胞抗原產(chǎn)生免疫應答反應[4]。初始的CD4+T細胞按照細胞因子分泌模式和生物學功能主要分為Th1細胞和Th2 細胞亞群。Th1/Th2細胞亞群間處于相對平衡的狀態(tài)，但當機體發(fā)生損傷時， Th1/Th2 之間的平衡狀態(tài)被打破，分泌不同的細胞因子，啟動機體的免疫反應，進而造成疾病的產(chǎn)生和發(fā)展[5]。

在睪丸扭轉過程中，生殖細胞損害程度主要取決于扭轉程度和扭轉持續(xù)的時間，這兩個方面決定著睪丸的缺血程度。隨著扭轉時間的延長，睪丸生精功能的受損程度逐步加重[6]。睪丸扭轉后的病理學損害表現(xiàn)為：睪丸組織充血水腫，生精上皮變薄，生精上皮細胞排列紊亂，細胞層次及數(shù)量減少。初級精母細胞內可見染色質濃縮和邊聚，形態(tài)異常，部分圓形精子細胞和初級精母細胞從生精上皮脫落入生精小管。睪丸扭轉遠期結果則可出現(xiàn)睪丸萎縮，生精停滯。隨著扭轉時間的延長，間質細胞和支持細胞也逐漸受到影響[7]。睪丸扭轉對睪丸的損傷主要包括生精上皮細胞凋亡，間質細胞萎縮，精子生成減少且形態(tài)異常，以及支持細胞的病理改變。

組織缺血再灌注機制尚未完全闡明，但目前認為它是多因素參與下的損傷性級聯(lián)反應。睪丸缺血再灌注時在局部血管內皮細胞受損后引起Th1細胞分泌細胞因子干擾素γ、腫瘤壞死因子-β 和IL-2等介導的細胞免疫，通過增強巨噬細胞組織相關抗原Ⅱ分子的表達，促進巨噬細胞對抗原的遞呈和自身活化，加重組織的免疫炎性反應，進一步加重睪丸組織的損害，甚至出現(xiàn)全身炎癥反應綜合征[8]。IL-12可以促使CD4+T淋巴細胞由初始的Th0分化為Th1細胞，促Th1細胞分泌干擾素γ增加，強化Th1細胞免疫應答[9]。在此損害同時存在Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-10和IL-13等通過B細胞介導的體液免疫，促B細胞產(chǎn)生抗體保護機體免受炎性損傷，保護睪丸組織減輕免疫病理損害。同時，Th2細胞因子IL-4能抑制巨噬細胞的活性，阻斷干擾素-γ活化巨噬細胞后的效應，因此能減緩有巨噬細胞介導的免疫應答[10]。

本實驗證實在睪丸扭轉缺血再灌注過程中，CD4+T淋巴細胞由Th0分化為Th1細胞亞型增多，并促Th1細胞分泌干擾素γ增加的IL-12升高明顯，與Th1細胞亞型分泌細胞因子干擾素γ成正相關。Th2細胞亞型分泌的細胞因子在缺血再灌注過程中分泌減少，IL-4在缺血階段分泌較再灌注時分泌增加，這可能與在損傷過程中Th2細胞分泌IL-4抑制Th1細胞分泌干擾素γ作用有關。在睪丸缺血再灌注病理過程中，患側睪丸生殖細胞凋亡明顯。

在睪丸缺血再灌注過程中，CD4+T淋巴細胞亞群之間的平衡發(fā)生偏移，Th1細胞亞型介導的細胞免疫占主導作用，其分泌細胞因子增多，Th2細胞亞型分泌受到抑制，這與生殖細胞凋亡存在正相關性。

1 Yazawa H, Sasagawa I, Suzuki Y, et al. Glucocorticoid hormone can suppress apoptosis of rat testicular germ cell induced by testicular ischemia. Fertil Steril 2001; 75(5)∶ 980-985

2 Annunziato F, Romagnani S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Res Ther 2009; 11(6)∶257

3 Turner TT, Tung KS, Tomomasa H, et al. Acute testicular ischemia results in germ cell-specifi c apoptosis in the rat. Biol Reprod 1997; 57(6)∶ 1267-1274

4 Raeburn CD, Sheppard F, Barsness KA, et al. Cytokines for surgeons. Am J Surg 2002; 183(3)∶ 268-273

5 O’Garra A, Arai N. The molecular basis of T helper 1 and T helper 2 cell differentiation. Trends Cell Biol 2000; 10(12)∶ 542-550

6 Sukhotnik I, Miselevich I, LurieM, et al. The time relation-ship between ipsilateral testicular ischemia and germ cell apoptosis in the contralateral testis. Pediatr Surg Int 2005; 21 (7)∶ 512-516

7 Turner TT, Bang HJ, Lysiak JL. The molecular pathology of experimental testicular torsion suggests adjunct therapy to surgical repair. J Urol 2004; 172(6 Pt 2)∶2574-2578

8 Hwang SS, Kim YU, Lee W, et al. Differential Expression of Nuclear Receptors in T Helper Cells. J Microbiol Biotechnol 2009; 19(2)∶ 208-214

9 Kaplan MH, Sun YL, Hoey T, et al. Impaired IL-12 responses and enhanced development of Th2 cells in Stat4-defi cient mice. Nature 1996; 382(6587)∶ 174-177

10 Burne-Taney MJ, Yokota-Ikeda N, Rabb H. Effects of combined T- and B-cell defi ciency on murine ischemia reperfusion injury. Am J Transplant 2005; 5(6)∶ 1186-1193

（2013-08-01收稿）

Effects of unbalance CD4+T cell subgroups on germ cell apoptosis during rat testicular torsion＊

Yang Qisheng, Zhao Yang, Zhou Xianlong, Ni Shaozhou, Shen Jun,Wang Xiang, Pan Zhengqi, Song Xiaobing
Department of Emergency ,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071,China

ObjectiveeTo investigate the effects of the unbalance of CD4+T cell subgroups on germ cell apoptosis during rat testicular torsion.MetthhooddssMale SD rats were randomly divided into three groups and there were 10 rats in each group. For rats in sham operation group, they served as the control; For rats in left unilateral testicular torsion group, their left testes were rotated 720 degree for 2 hours; For rats in left testicular torsion reset group, their testes were reseted after 2 hours testicular torsion. At 24 hours after operation, levels of serum cytokines IFN-γ, IL-12, IL-4 and IL-10 were measured by ELISA. Germ cell apoptosis index in left testes of the rats was determined by TUNEL.RessuullttssCompared with that of the sham operation group, the levels of Th1 type cytokines were signifi cantly increased in torsion and detorsion groups(P＜0.05). The levels of Th2 type cytokines such as IL-4, IL-10 were obviously lower in torsion and detorsion groups than that in sham operation group (P＜0.05). CD4+T cell subgroups was unbalance during testicular torsion in rats. The apoptosis index of germ cells was signifi cantly higher in torsion and detorsion groups than that of sham operation group.ConcluussiioonnCD4+T cell subgroups is unbalance in ischemia reperfusion injury in rat testis, which may be associated with germ cell apoptosis.

R 697.2

資助∶ 湖北省自然科學基金（項目號2011CHB026）

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.003