陳 亮 付 杰 于 麗 齊 雯 馬京梅 潘 虹 陳 菲張 娜 王 晟 鞠慧巖 薛 晴 左文莉 徐 陽 楊慧霞

北京大學第一醫(yī)院生殖與遺傳醫(yī)療中心（北京 100034）

男性不育癥患者外周血染色體核型分析的臨床意義*

陳 亮 付 杰 于 麗 齊 雯 馬京梅 潘 虹 陳 菲張 娜 王 晟 鞠慧巖 薛 晴 左文莉 徐 陽 楊慧霞

北京大學第一醫(yī)院生殖與遺傳醫(yī)療中心（北京 100034）

目的基于外周血染色體核型分析，探討男性不育癥患者染色體核型異常的特點及臨床意義。方法回顧性分析男性不育患者的外周血染色體核型分析結果，對異常核型的檢出率及臨床效應進行分析與總結。結果在813例患者中，檢出染色體異常55例，檢出率為6.76 %。其中，染色體數(shù)目異常36例，檢出率為4.43%，占總異常數(shù)目的65.4%；染色體結構異常17例，檢出率為2.09%，占總異常數(shù)目的30.91%；假兩性畸形2例（核型為46, XX，社會性別為男性）。其中，最常見的染色體數(shù)目異常為46, XXY，即克氏征（非嵌合型）；最常見的結構異常為染色體相互易位14例，其中羅氏易位5例，涉及13、14、15、22及22號等染色體。導致男性不育臨床效應的直接表現(xiàn)分別為少、弱、畸形精子癥以及無精子癥等。另外，共檢出44例染色體多態(tài)性，檢出率為5.41%。其中，常染色體多態(tài)性11例，檢出率為1.35%，占總多態(tài)性數(shù)目的25%（11/44），表現(xiàn)為隨體變異及次縊痕增長。Y染色體的多態(tài)性包括大Y核型21例，檢出率為2.58%，占多態(tài)性總數(shù)目的44.73%（21/44）；小Y核型12例，檢出率為1.48%，占多態(tài)性總數(shù)目的27.27%（12/44）。最常見的多態(tài)性為Y染色體的變異，其次是常染色體的多態(tài)性。染色體多態(tài)性導致男性不育臨床效應的直接表現(xiàn)為少、弱、畸形精子癥及無精子癥等。結論染色體異常及多態(tài)性變異均可能是導致男性生育力低下的重要因素，主要包括性染色體數(shù)目異常（非嵌合克氏征）、Y染色體多態(tài)性、染色體倒位及易位等。對于男性不育癥，染色體核型分析是重要的輔助診斷依據，應用ICSI技術能解決部分遺傳相關男性不育患者的體外受精問題，合理應用PGD技術進行移植前胚胎選擇，能避免遺傳缺陷的傳代，具有重要臨床意義。

不育; 男性; 染色體畸變; 多態(tài)現(xiàn)象, 遺傳; 核型分析

Key woorrddssinfertility; male; chromosome aberrations; polymorphism,genetic; karyotyping

夫婦不采用任何避孕措施規(guī)律夫妻生活1年以上、由于男方因素造成女方不孕者稱為男性不育，大約有30%的男性不育患者表現(xiàn)為嚴重少、弱精子癥或無精子癥[1,2]。非梗阻性無精子癥和嚴重少精子癥的病因尚不清楚，其中約有30%的患者是由于染色體畸變或基因突變等遺傳學因素引起的[3-5]。

輔助生殖技術的發(fā)展讓許多嚴重少精子癥、無精子癥患者擁有了自己的下一代。雖然體外受精/單精子胞漿內顯微注射-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）革命性地改變了不孕癥的治療，與之相伴隨，潛在的遺傳風險對子代的影響也相應提高，同時，仍然有眾多患者反復移植優(yōu)質胚胎，但卻沒有獲得良好的妊娠結局，研究表明可能與染色體異常相關[6]，因此，胚胎移植前篩查相應的遺傳學缺陷，對于節(jié)省醫(yī)療費用，有效配置醫(yī)療資源，制定下一步診療策略都非常重要。另外，目前的胚胎移植前遺傳學診斷技術（PGD）并不能完全篩查所有的遺傳疾病。因此，有必要深入總結和評估男性不育癥特別是重度少、弱精子癥以及特發(fā)性無精子癥患者的細胞遺傳學特點，為指導臨床治療提供支撐及依據。

本研究通過回顧性分析男性不育患者的外周血染色體核型檢查結果及各種染色體異常的檢出率，總結男性不育遺傳缺陷的規(guī)律并分析其臨床意義。

對象與方法

一、研究對象

回顧性分析2007年1 月至2013 年6月北京大學第一醫(yī)院婦產科遺傳研究室男性不育患者的外周血染色體核型分析結果，其中包括少精子癥、弱精子癥、嚴重少及弱精子癥或無精子癥及其他不明原因不育癥患者。根據WHO第四版的精液檢驗的相關診療指南，嚴重少精子癥是指：精子計數(shù)小于5×106/ml；嚴重弱精子癥是指：前向運動精子的比率低于10%，無精子癥定義為至少兩次精液高速離心沉渣鏡檢結果顯示無精子?？偣灿?13例不育癥患者納入本次研究。所有檢測者均在?？崎T診就診，均進行了體格檢查、?？企w檢和至少兩次精液分析。排除內分泌、免疫、感染和生殖器異常等因素，經專科醫(yī)師診斷具備進行細胞遺傳學核型分析的指征，常規(guī)抽取外周血，進行染色體核型分析。

二、細胞遺傳學分析

常規(guī)外周血淋巴細胞培養(yǎng)68～72h，收獲前加秋水仙素作用于細胞3～4h后常規(guī)方法制片。標準技術Trysin-Giemsa染色，G顯帶。計數(shù)培養(yǎng)的30個細胞中期分裂相, 分析5個核型；染色體異常者分析10個核型。根據人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）對所檢染色體進行命名。人類染色體的多態(tài)性表現(xiàn)在結構異染色質的數(shù)量和位置的改變。有高度重復順序的DNA 區(qū)域，為異染色質區(qū), 分別位于人類染色體的1、9、16號染色體、Y染色體的異染色質區(qū)和著絲粒區(qū)，至少有2名遺傳學家對染色體異常的結果進行分析、認定及復核。

結 果

一、男性不育患者染色體核型異常分析結果

在813例患者中，檢出染色體異常55例，檢出率為6.76 %。其中，染色體數(shù)目異常36例，檢出率為4.43%，占總異常數(shù)目的65.4%；染色體結構異常17例，檢出率為2.09%，占總異常數(shù)目的30.91%；假兩性畸形2例（核型為46, XX，社會性別為男性）。其中，最常見的染色體數(shù)目異常為46, XXY，即克氏征（非嵌合型）；最常見的結構異常為染色體相互易位14例，其中羅氏易位5例，涉及13、14、15、22及22號等染色體。導致男性不育臨床效應的直接表現(xiàn)分別為少、弱、畸形精子癥以及無精子癥等，見表1。

表1 男性不育中染色體核型異常分析結果

二、男性不育患者染色體多態(tài)性的核型分析結果

在813例患者中，共發(fā)現(xiàn) 44例染色體多態(tài)性，檢出率為5.41%。其中，常染色體多態(tài)性11例，檢出率為1.35%，占總多態(tài)性數(shù)目的25%（11/44），表現(xiàn)為隨體變異及次縊痕增長，核型分別是：46, XY, 21pstk+（2例）；46, XY, 15ps+（2例）；46，XY, 15pstk+（1例）；46, XY, 1qh+（2例）；46, XY, 11qh+（1例）；46, XY, 16ph+（1例）；46, XY, 16qh+（2例）。 Y染色體的多態(tài)性包括大Y核型21例，檢出率為2.58%，占多態(tài)性總數(shù)目的44.73%（21/44）；小Y核型12例，檢出率為1.48%，占多態(tài)性總數(shù)目的27.27%（12/44）。最常見的多態(tài)性變異為Y染色體的變異，其次是常染色體的多態(tài)性。染色體多態(tài)性導致男性不育臨床效應的直接表現(xiàn)為少、弱精癥及無精癥等，見表2。

表2 男性不育中染色體多態(tài)性的核型分析結果

討 論

本文通過回顧性臨床研究，探討了男性不育患者中染色體核型異常的檢出率，并進行了分析，為總結男性不育癥的細胞遺傳學規(guī)律，指導輔助生育技術的選擇提供了借鑒。在大約50%的不孕不育夫婦中，男性因素是主要或者協(xié)同因素，廣義的男性生殖功能障礙包括不孕與不育兩個層面。第一層面是指男方原因導致女方未能受孕；第二個層面是指對夫妻雖然能夠妊娠，但不能正常維持整個妊娠過程并分娩健康活嬰，導致不良孕產結局[1,2]。本文中的男性不育癥指的是規(guī)律夫妻生活至少1年但未能使女方受孕者，不包括配偶具有不良妊娠史的病例。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，克氏征（Klinefelter綜合征）仍是導致男性不育癥的最常見的染色體核型異常（研究結果中表1）。對813例男性不育患者進行染色體核型分析發(fā)現(xiàn)共有36例染色體數(shù)目異常，其中，33例為Klinefelter綜合征（非嵌合型），核型為47, XXY，臨床效應為男性不育，患者的臨床表現(xiàn)為小睪丸及無精子癥。睪丸活檢病理學顯示大部分生精小管萎縮硬化或透明化，部分生精小管僅剩支持細胞，睪丸間質細胞數(shù)目減少。提示重度的睪丸生精功能障礙[7-10]。發(fā)病機制是由于多余的X染色體在減數(shù)分裂時不分離所致，多余的X染色體的劑量效應導致了該類核型患者睪丸小而質硬，睪酮合成功能低下，發(fā)生嚴重少精子或無精子癥[8]。隨著男科及生殖醫(yī)學的進展，應用睪丸顯微外科取精手術聯(lián)合輔助生殖技術，使得本類患者有希望成為遺傳學意義上的父親[8,9]。國內亦有顯微睪丸取精術成功案例的報道[10]。ICSI技術、PGD技術與睪丸顯微外科技術的交叉與互補，使得克氏征患者實現(xiàn)作為遺傳學意義上父親的夢想成為可能。

本研究發(fā)現(xiàn)男性不育中染色體結構異常還包括染色體相互易位。在本組中，檢出相互易位14例；其中羅氏易位5例，涉及13、14、15 及22號染色體。染色體相互易位導致男性不育臨床效應的直接表現(xiàn)為弱精子癥，少精子癥及無精子癥等。相互易位是指兩條染色體同時各發(fā)生一處斷裂和變位重接而形成的兩條結構上重排的染色體，相互易位如無遺傳物質的丟失為平衡易位。平衡易位由于沒有遺傳物質的丟失，保留原有基因的總數(shù)，只發(fā)生了基因在染色體上相對位置的變化，因此本人表型正常，但可以遺傳[11,12]。 研究發(fā)現(xiàn)男性染色體平衡易位攜帶者，精子發(fā)生的第一次減數(shù)分裂中期的二倍體中交叉圖像減少，交叉與聯(lián)會有關，并影響二倍體的形成，使減數(shù)分裂受阻，導致精子生成減少、異常及男性不育。羅氏易位是指兩個具有近端著絲粒的染色體（13，14，15，21，22號染色體）于著絲點附近斷裂，著絲點融合，兩條染色體長臂重接成為易位染色體，由于丟失的兩條短臂上所含基因甚少，羅氏易位攜帶者通常表型、智力正常，但是在精子減少分裂中會出現(xiàn)染色體分離不均衡現(xiàn)象，因此，男性羅氏易位常常伴有少、弱精癥導致男性不育以及配偶的不良妊娠事件[13,14]。目前，ICSI技術可以解決男性羅氏易位少、弱精子癥的受精問題[14]，對于受精后胚胎核型異常引起的流產、畸形兒等不良妊娠結局，應用PGD技術，利用熒光原位雜交FISH（fluorescence in situ hybridization）對體外受精形成的胚胎進行檢測，選擇染色體平衡的胚胎進行移植，不僅能解決男性羅氏易位患者的生育問題，同時，還可以避免因反復流產、胚胎停育、出生畸形兒等帶來的精神及身體上的痛苦和傷害[14]。

本研究還發(fā)現(xiàn)男性不育中染色體結構異常還包括倒位，共檢出3例，占染色體異?？倲?shù)目的5.45%，涉及9號及11號染色體。染色體倒位是指染色體發(fā)生兩次斷裂后，兩斷點之間的片段旋轉后重接，造成染色體上基因順序的重排。倒位發(fā)生在長臂和短臂之間稱臂間倒位。其中inv(9)在人群中發(fā)生率較高[15,16]，inv(9)是一種多態(tài)現(xiàn)象，還是屬于結構異常, 目前觀點不一致[16]。倒位由于本身沒有遺傳物質的丟失，攜帶者本身多無癥狀，但由于染色體結構異常，減數(shù)分裂開始時倒位的染色體和同源的正常染色體之間的配對發(fā)生困難，從而影響精子發(fā)生過程，使精子發(fā)生過程阻滯在精母細胞階段，而不能分化成正常精子，而使患者表現(xiàn)為無精子癥或少、弱精子癥導致男性不育以及配偶的不良妊娠結局[15]。對于染色體倒位患者的治療，ICSI技術能解決男性倒位攜帶者少、弱精子癥的受精問題，對于反復胚胎停育、自然流產等，需要借助PGD技術進行胚胎的篩選。

本研究結果提示：染色體多態(tài)性現(xiàn)象在男性不育癥中常見，尤其是Y染色體的長度變異更值得關注。本研究結果共檢出染色體多態(tài)性44例，檢出率為5.41%。其中，常染色體多態(tài)性11例，檢出率為1.35%，占總多態(tài)性數(shù)目的25%（11/44），表現(xiàn)為隨體變異及次縊痕增長（見表2）。男性不育臨床效應的直接表現(xiàn)包括少、弱精子癥及無精子癥等。染色體多態(tài)性以往多認為無臨床效應，但當前的觀點認為多態(tài)性與男性不育及不良妊娠事件關系密切[17]，我們的研究結果也支持這一觀點。本研究結果顯示次縊痕增長多態(tài)性涉及1、11、16號染色體（見表2）。這與其他的研究報道一致。由于1、9、16號染色體次縊痕異染色質區(qū)是易發(fā)生自發(fā)和誘發(fā)斷裂的部位, 它的增加或減少可能使得紡錘絲微管不能與染色體正常連接, 干擾染色體的正常運動和分離, 致染色體數(shù)目異常, 產生非整倍體, 而引起一系列臨床效應[17]。本研究發(fā)現(xiàn)染色體隨體變異多態(tài)性共5例，涉及15，21號染色體，即D/G組染色體，核型分別是：46, XY, 21pstk+（2例）；46, XY, 15ps+（2例）；46, XY, 15pstk+（1例），D/G組染色體的著絲粒與其隨體區(qū)相鄰，隨體變異可能增加端著絲粒染色體的不分離，從而導致精子發(fā)生染色體非整倍性變異或使得減數(shù)分裂中異常配子產生的可能性增加，產生男性不育的臨床效應。

Y染色體變異對于男性不育的影響目前觀點并不一致[18-23]，但我們的結果提示Y染色體長度變異具備一定的臨床效應，導致少、弱精子癥及無精子癥等。本組共檢出大Y及小Y染色體變異共33例，檢出率為4.06%。Y染色體的多態(tài)性包括大Y核型21例，檢出率為2.58%，占多態(tài)性總數(shù)目的44.73%（21/44）；小Y核型12例，檢出率為1.48%，占多態(tài)性總數(shù)目的27.27%（12/44），本研究結果與其他研究結果相一致[18-23]。Y染色體的多態(tài)性臨床效應為無精子癥及少、弱精子癥，可能是由于Y染色體長臂異染色質區(qū)域延長，可使該區(qū)特有的串聯(lián)重復序列過多重復，在精子生成過程中，影響生精細胞的減數(shù)分裂，不能形成成熟的精子，從而發(fā)生無精子癥和少、弱精子癥[19-22]。對于小Y核型，與男性不育的關聯(lián)更為密切，這是因為Y染色體長臂（Yq11）常染色質區(qū)存在精子發(fā)生相關基因，稱為無精子因子（azoospermia factor, AZF），AZF的缺失會導致無精子癥或弱精子癥等臨床效應[23-25]。因此，Y 染色體的長度變異不能僅僅被認為是一種多態(tài)性，而可能是導致男性不育的重要因素之一，具體機制值得深入研究。另外，也不能僅僅將Y染色體長度變異作為一種核型來研究，應該再進行分類[18]，后續(xù)研究需要在分子生物學層面對其調控機制進行詳細闡述。

綜上所述， 染色體異常及多態(tài)性變異與精子發(fā)生及其質量關聯(lián)密切，染色體數(shù)目結構異常、多態(tài)性變異均是導致男性生育力低下的重要因素，主要包括性染色體數(shù)目異常（非嵌合克氏征）、Y染色體多態(tài)性（大Y及小Y變異）、染色體倒位及平衡易位等。在男性不育癥的臨床診療中，染色體核型分析是重要的輔助診斷依據，應用ICSI技術能解決部分遺傳相關男性不育患者少、弱精子及無精子癥導致的體外受精難題，而謹慎并合理地應用PGD技術對正常胚胎進行選擇，則能避免遺傳缺陷的傳代，具體值得深入研究。

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（2013-10-15收稿）

The clinical significance analysis of the cytogentic abnormality in the infertile males＊

Chen Liang, Fu Jie, Yu Li, Qi Wen, Ma Jingmei, Pan Hong, Chen Fei, Zhang Na, Wang Sheng, Ju Huiyan, Xue Qing, Zuo Wenli, XuYang, Yang Huixia
Medical Center of Reproductive and Genetics, Peking University fi rst Hospital, Beijing 100034, China

ObjectiveeTo investigate the clinical signifi cance of the cytogenetic abnormality in the infertile males.MetthhooddssCytogenetics of patients was examined by culturing peripheral-blood lymphocyte and G-banding technology, and karyotyping analysis technique were used to study the abnormality and the polymorphism of chromosomes.ResultssOf 813 infertile men, 55 (6.76 %) were detected to have chromosomal abnormalities in chromosomal analysis, including 36 cases with the numeric abnormality (4.43%), 17 cases with chrom osomal rearrangement (2.09%). In 55 cases with chromosomal abnormalities, the constituted ratios of numeric aberration and the rearrangement were 65.4% and 30.91% respectively. Two cases of male pseudohermaphroditism were detected. Klinefelter syndrome and balanced reciprocal translocations were the most common aberration of the chromosomal abnormalities. In addition, 44 cases were detected to have polymorphicvariations (5.41%,44/813), including 11 cases with the somatic chromosomal polymorphic variations (1.35%,11/813), 21 cases with the big Y(2.58%,21/813) and 12 cases with bit Y chromosomal(1.48%,12/813). The somatic chromosomal polymorphism included secondary constriction increases, satellite increases in the D/G group. Y chromosomal polymorphism was the most common chromosomal polymorphism. The main clinical features of the male infertility attributing to the chromosomal abnormality and polymorphism were azoospermia, abnormal spermatozoa (oligozoospermia, asthenospermia and teratozoospermia).ConcluussiioonnChromosome and abnormality polymorphisms showed negative effects on the male fertile function. The infertile males with chromosomal abnormality or polymorphisms defi nitely had an increasing risk in heredity. Karyotype testing screening is necessary for the infertile males, and PGD is helpful to decrease the genetic risk.

R 698.2; R 394.22

資助∶ 北京市自然科學基金資助項目（編號∶ 7142158）

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.004