乜照燕吳海峰甄秀麗張 娜郭麗娜趙素英呂翠婷

1. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院（石家莊 050011）；2. 河北省胸科醫(yī)院

短時受精聯(lián)合早期補救性卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射在重度畸形精子癥患者中的臨床應(yīng)用

乜照燕1*吳海峰2甄秀麗1張 娜1郭麗娜1趙素英1呂翠婷1

1. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院（石家莊 050011）；2. 河北省胸科醫(yī)院

目的評估短時受精聯(lián)合早期補救性卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）術(shù)在重度畸形精子癥患者中的臨床應(yīng)用。方法 235例重度畸形精子癥患者（1%≤精子正常形態(tài)率＜5%）行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期隨機分組， 101例直接實施ICSI為A組，134例實施短時受精聯(lián)合早期補救性ICSI為B組，短時受精后4～5h行極體觀察，其中109例大于30%可見雙極體列為B1組， 25例早期判斷未見雙極體或小于30%未見雙極體行早期補救性ICSI術(shù)列為B2組。比較不同組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率及臨床結(jié)局。結(jié)果3 組的卵子成熟率分別為83.93%，87.03%和90.48%，正常受精率分別為78.76%，72.49%和75.61%，異常受精率分別為6.11%，14.88%和9.76%，卵裂率分別為83.93%，85.89%和84.96%，優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為49.45%，50.49%和53.23%，胚胎植入率分別為28.10%，26.67%和32.00%，臨床妊娠率分別為43.66%，43.04%和47.62%，流產(chǎn)率分別為6.45%，8.82%和10.00%。3 組的卵子成熟率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），異常受精率在B1組有增高趨勢，與其它組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論短時受精聯(lián)合早期補救性ICSI在重度畸形精子癥患者有應(yīng)用價值，可以最大限度的減少ICSI比率，獲得好的臨床結(jié)局。

精子/畸形; 卵胞漿內(nèi)單精子注射, 男性不育; 受精

在不孕夫婦中，男方因素所占比例為40%左右。精液分析是評估男性生育能力的最客觀和最直接的重要手段， 精子形態(tài)比精液其它參數(shù)更能體現(xiàn)男性生育價值， 在男性不育中約50% 存在精子形態(tài)異常。但目前有關(guān)精子形態(tài)的評定標(biāo)準(zhǔn)和它在體外受精中所起的作用一直存在爭議。2010 年WHO出版了第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》，新版手冊修訂最明顯的內(nèi)容之一是精子形態(tài)學(xué)的判讀標(biāo)準(zhǔn)和正常參考值，將精子形態(tài)4%認(rèn)為正常參考值[1]，這也引起巨大爭議，精子形態(tài)是影響受精的重要因素之一[2,3]，一般認(rèn)為正常形態(tài)精子＜15%體外受精能力下降。嚴(yán)重畸形精子癥一直被認(rèn)為是卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的治療指征[4]，然而一些臨床實踐表明ICSI并不是嚴(yán)重畸形精子癥唯一最佳助孕方式[5,6]，嚴(yán)重畸形精子行ICSI需要重新審視，如何防范受精失敗和嚴(yán)格控制ICSI 技術(shù)指征引起了生殖醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。隨著早補救ICSI的應(yīng)用，為重度畸形精子癥患者實施常規(guī)IVF提供了保證，本研究擬對重度畸形精子癥患者采用短時受精結(jié)合早期補救性ICSI 技術(shù)，對重度畸形精子癥患者授精方式進(jìn)行評估。

對象與方法

一、研究對象

接受常規(guī)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療的235對重度畸形精子癥（1%≤精子正常形態(tài)率＜5%）夫婦。極度畸形精子癥患者即精子正常形態(tài)＜1%直接實施ICSI不在本研究范圍，為排除女性不孕因素對卵子質(zhì)量、受精、著床等的影響，以年齡＜35歲、基礎(chǔ)卵泡生成素（FSH）水平≤10 mlU/mL、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)≥10個為入組條件。排除標(biāo)準(zhǔn)為：多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥或子宮畸形等。男方年齡23～37歲，女方年齡22～34歲。不孕年限l～10年。101例直接實施ICSI列為A組；134例實施短時受精聯(lián)合早期補救性ICSI列為B組，短時受精后4～5h行極體觀察，其中109例大于30%可見雙極體列為B1組， 25例早期判斷未見雙極體或小于30%未見雙極體行補救性ICSI術(shù)列為B2組。

二、研究方法

（一）精液常規(guī)檢查

精液液化后按照《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》(第五版)要求行精液常規(guī)檢查。

（二）精子形態(tài)學(xué)分析

采用Diff-Quick快速染色法染色，遵照新版手冊的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，只有帶有尾部的可辨認(rèn)精子才考慮進(jìn)行精子計數(shù)，且所有形態(tài)處于臨界狀態(tài)的精子均列為異常， 每張涂片計數(shù)兩次， 每次計數(shù)200條精子， 計算精子正常形態(tài)率。如兩次計數(shù)的差值在可接受的范圍內(nèi)，則取兩次計數(shù)的均值； 若兩次計數(shù)的差值超出可接受的范圍， 則重新涂片計數(shù)。

（三）控制性促排卵

采用長方案控制性超排卵，于排卵后第7天給予醋酸曲普瑞林0.1mg（商品名：達(dá)必佳，0.1mg/支，德國輝凌制藥有限公司，注冊證號：H20100365）皮下注射，第14天左右給予注射用重組人促卵泡激素 150-225IU（商品名：果納芬，75IU/支，瑞士默克雪蘭諾有限公司，注冊證號：S20080030）啟動促排卵，當(dāng)主導(dǎo)卵泡中有1個直徑達(dá)18 mm或2個達(dá)17 mm或3個達(dá)16mm，雌激素達(dá)到每個卵泡約200～300 pg/ mL，給予注射用重組人絨促性激250μg（商品名：艾澤，250μg /支，瑞士默克雪蘭諾有限公司，注冊證號：S20110045），36～37 h后取卵。

（四）短時受精

A組按以前標(biāo)準(zhǔn)直接行ICSI，取卵后卵子體外成熟培養(yǎng)3～4h 剝除卵周顆粒細(xì)胞后行ICSI，B組獲取的卵細(xì)胞體外培養(yǎng)3～4 h 按4～5萬精子/卵細(xì)胞的比例加入精子，卵細(xì)胞與精子共孵育4 h后，用拉細(xì)的巴氏吸管輕輕吹打卵丘復(fù)合物，除盡卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，置于新鮮培養(yǎng)液微滴中，觀察第二極體出現(xiàn)情況，大于30%MⅡ見第二極體列為B1組，全部MⅡ卵子或小于30%MⅡ卵子未見第二極體則受精5h 后再次觀察，仍未發(fā)現(xiàn)全部MⅡ卵子或小于30%MⅡ卵子未見第二極體立即行早期補救性ICSI列為B2組。

（五）受精觀察胚胎評估及移植

受精及胚胎培養(yǎng)在恒溫倒置鏡下觀察受精情況，以出現(xiàn)兩原核作為正常受精標(biāo)志。將正常受精的合子移入新鮮的培養(yǎng)液微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，并在授精后48h 及72h 觀察胚胎發(fā)育情況。并評定胚胎質(zhì)量。優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：第3天胚胎細(xì)胞數(shù)≥6個，碎片≤20%。

（六）胚胎移植與黃體支持

選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植，移植胚胎數(shù)≤3 個，剩余Ⅱ級以上胚胎冷凍保存，并同時給予黃體支持。移植術(shù)后第14天測血β-hCG 陽性， 35d B 超觀察宮腔內(nèi)孕囊數(shù)和心管搏動確定臨床妊娠。

（七）統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、三組患者女方基本情況比較

三組患者在女方年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)等方面的差異無顯著性（P均＞0.05），見表1

表1 三組患者女方基本情況比較

表2 三組患者控制性超排卵情況比較

二、三組患者控制性超排卵情況比較

在控制性超排卵中，三組患者Gn天數(shù)、Gn用量、HCG日E2水平、HCG日子宮內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2

三、三組患者精液分析情況比較

三組精液量、精子密度、精子活動率、前向運動精子百分率、精子正常形態(tài)百分率均無顯著性差異（P均＞0.05），見表3

表3 三組精液分析情況比較

四、三組畸形精子癥患者體外受精結(jié)局的比較

三組患者受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、植入率、妊娠率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。B1組異常受精率有增高趨勢，與其他兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表4

表4 三組畸形精子癥患者體外受精結(jié)局的比較

討 論

ICSI 是在體外顯微鏡下將單個精子直接注入成熟卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)，使精、卵結(jié)合的一種顯微操作技術(shù)。該技術(shù)主要應(yīng)用于男性因素不育， 成為男性嚴(yán)重少弱精子癥、畸形精子癥及阻塞性無精子癥的有效治療方法。Kruger等[7]首先提出嚴(yán)格的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類用來評估精子質(zhì)量，新版 WHO5 評估精子并用于指導(dǎo)輔助生育治療對形態(tài)學(xué)的評估標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格，形態(tài)正常精子百分率的參考值范圍由WHO4 的15%下降到WHO5 的4%。精子形態(tài)是衡量精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。常規(guī)IVF周期中，精子形態(tài)可影響受精率[8]，正常形態(tài)精子＜5%被認(rèn)為是重度畸形精子癥列入ICSI助孕指征，ICSI對精子的選擇基于精子活力和大體形態(tài)，越過了自然選擇過程，克服了精子形態(tài)缺陷導(dǎo)致的受精失敗，使精、卵人為地“結(jié)合”到了一起，但可能會介入受損的父代基因[9,10]或?qū)е掠≯E基因的損傷[11]，有研究證實ICSI有可能通過對雄原核H3K9雙甲基化的影響進(jìn)而影響胚胎生長發(fā)育[12]。ICSI 的介入性操作存在安全隱患，充分給予患者精卵自然結(jié)合的受孕機會，預(yù)防和避免重度畸形精子癥受精失敗成為改善某些IVF結(jié)局的重要環(huán)節(jié)，為此尋找受精的最早期證據(jù)非常重要。Chen等[13]加入精子后6 h 通過觀察第二極體的釋放確定受精與否，受精失敗即行早期補救，獲得了高妊娠率，短時受精結(jié)合補救ICSI，可成為預(yù)防受精失敗的有效方法[14,15]。補救性ICSI的出現(xiàn)為盡早挽救可能受精失敗的卵子提供了可能，同時又盡可能的避免了ICSI過度應(yīng)用時人為選擇精子的弊端。本研究評估了短時受精聯(lián)合早期補救性ICSI在重度畸形精子癥患者中的臨床應(yīng)用，結(jié)果如下。

夫婦雙方的年齡， 不孕年限以及女方控制性超排卵情況可影響受精率、胚胎質(zhì)量、妊娠結(jié)局。故本研究對入組病例的一般情況和控制性超排卵進(jìn)行比較，三組的之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0. 05）。

本研究結(jié)果顯示，實施早補救組25例，其中原發(fā)不孕16例，繼發(fā)不孕9例，比較三組間受精率結(jié)果顯示，正常受精率和異常受精率結(jié)果均無顯著性差異（P＞0.05）， B1 組的異常受精率（14.88%）略高于B2組（9.76%）和A組（6.11%），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，短時受精的3PN 率明顯升高，可能原因為短時受精過早去除卵丘細(xì)胞，使卵母細(xì)胞與周圍的卵丘細(xì)胞及其分泌因子分離，脫離了卵丘細(xì)胞存在的微環(huán)境，使多精受精的發(fā)生增加；去除卵丘細(xì)胞機械刺激可能會損傷卵母細(xì)胞，增加多精入卵的機會；為達(dá)到改善畸形精子癥患者受精率的目的增加精子受精濃度。

優(yōu)質(zhì)胚胎率方面，三組間結(jié)果均無顯著性差異（P＞0. 05），體外受精中，胚胎質(zhì)量更多地取決于卵母細(xì)胞的質(zhì)量，卵齡對卵母細(xì)胞的質(zhì)量有直接影響，隨著卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞漿和細(xì)胞核過度成熟，卵子質(zhì)量退化，卵子老化程度加劇，從而影響受精及胚胎發(fā)育的潛能[16]。因此盡早發(fā)現(xiàn)受精失敗并行補救非常重要。本研究的結(jié)果顯示如果該患者的卵子不存在受精障礙，40%左右的卵子會在授精后4h排出第二極體， 80%的卵子會在授精后5h排出第二極體。在觀察過程中，若極體邊界不清晰，需輕輕撥動卵子，微調(diào)體視鏡焦距，直至能清晰觀察；若兩個極體體積差別較小，只要邊界清晰可見，優(yōu)先考慮觀察到的是第二極體；若兩個可疑極體體積差別較大甚至數(shù)倍，則需要考慮是否是卵周間隙碎片樣雜質(zhì)；若極難判斷是否是第二極體或極體破碎、形態(tài)異常需要延長觀察時間、結(jié)合胞漿情況以及極體是否有位置變化來判斷。早期受精的判斷時機、判斷依據(jù)以及早期失敗補救標(biāo)準(zhǔn)的確立，將有助于該類患者胚胎結(jié)局的改善。

在臨床結(jié)局的著床率、妊娠率、流產(chǎn)率三組間結(jié)果均無顯著性差異（P＞0. 05），但有研究顯示，早期補救ICSI 結(jié)局雖然優(yōu)于晚時補救ICSI，但與常規(guī)IVF 相比有一定差距，表明卵母細(xì)胞最佳受精窗口可能比所估計的時間還要短或者有其他影響受精的原因，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局[17]。本研究例數(shù)極少，未發(fā)現(xiàn)臨床結(jié)局方面的差異，需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究。

總的來說，對于重度畸形精子癥患者精子密度及活力達(dá)到常規(guī)IVF 要求，選擇常規(guī)IVF 治療是可行的，對于受精失敗者，即刻行早期補救ICSI，也可獲得滿意的妊娠結(jié)局，既避免了ICSI 選擇的擴(kuò)大化、也避免了常規(guī)IVF-ET受精失敗的擔(dān)憂。重新審視嚴(yán)重畸形精子受精方式，充分給予患者精卵自然結(jié)合的受孕機會，嚴(yán)格控制異常形態(tài)精子行ICSI治療指征，對避免異常遺傳基因的傳遞、提高輔助生殖技術(shù)的安全性有積極的意義。

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（2013-10-25收稿）

Clinical application of short-period fertilization and early rescue intracytoplasmic sperm injection in the fertilization of severe teratozoospermia

Nie Zhaoyan1*, Wu Haifeng2, Zhen Xiuli1, Zhang Na1, Guo Lina1, Zhao SuYing1, Lv Cuiting1
1. The Fourth Affi liated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei 050011, China; 2. Chest Hospital of Hebei Province Corresponding author: Nie Zhaoyan, E- mail: niezhaoyan@163.com

ObjectiveTo evaluate clinical application of short-period fertilization combined with early rescue intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique in fertilization of severe abnormal sperm.MethodsTotal 235 patients with severe teratozoospermia （1%≤Normal sperm morphology rate＜5%）for in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) cycles for egg were randomly divided into two groups. 101 cases of direct implementation of the ICSI as group A, 134 cases for short-period fertilization combined with early rescue ICSI as group B. Among group B, cumulus cells were removed after fertilization 4～5h, second polar body of oocytes was observed, in which 109 cases more than 30% visible bipolar body as B1 group, 25 cases of early judgment no less than 30% of bipolar body performed early remedial ICSI surgery as a group B2.The fertilization rate, cleavage rate, high-quality embryo rate, implantation rate and clinical outcome were comparatively analyzed among different groups.Results Egg maturation rates of three groups were 83.93%, 87.03% and 90.48% respectively, normal fertilization rates were 78.76%, 72.49% and 75.61%, abnormal fertilization rateswere 6.11%, 14.88% and 9.76%, cleavage rates were 83.93%, 85.89% and 84.96%, high-quality embryos were 49.45%, 50.49% and 53.23%, implantation rates were 28.10%, 26.67% and 32.00%, clinical pregnancy rates were 43.66%, 43.04% and 47.62%, miscarriage rates were 6.45%, 8.82% and 10.00%. there were no signifi cant difference in egg maturation rate, normal fertilization rate, cleavage rate , high-quality embryo rate, implantation rate, clinical pregnancy, miscarriage rates among three groups different (P>0.05). Abnormal fertilization rate in group B had an increasing trend, but the difference was not statistically signifi cant (P>0.05).Conclusion Short-period fertilization combined with early rescue Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) show great value for fertilization of patients with severe abnormal sperm. A good clinical outcome can be obtained if minimizing the ICSI.

spermatozoa/abnormalities; intracytoplasmic sperm injection, male infertility; fertilization

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.007

R 321-33

*通訊作者, E-mail: niezhaoyan@163.com