孫健瑋王劍松*劉子超楊峻峰馬 輝鄭立民

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明 650101）; 2.昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系; 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科

PTEN能負調(diào)控前列腺癌PC-3細胞Raf-1磷酸化

孫健瑋1王劍松1*劉子超2楊峻峰1馬 輝1鄭立民3

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明 650101）; 2.昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系; 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科

目的探討 PTEN基因表達變化對Raf-1磷酸化的影響。方法用Western blot方法分別檢測PTEN基因過表達和干擾后前列腺癌PC-3細胞Raf-1的磷酸化水平。結(jié)果PTEN基因過表達后，PC-3細胞的磷酸化Raf-1 減少61.1%；PTEN基因干擾后，磷酸化Raf-1增加75.1%。結(jié)論PTEN可負調(diào)控前列腺癌PC-3細胞Raf-1的磷酸化。

PTEN磷酸水解酶; Raf激酶類; 前列腺腫瘤

前列腺癌常見于老年男性，其發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，美國2012年男性新增前列腺癌患者達241 740例，占同期男性全部新增癌癥患者總數(shù)的28.5%，位居癌癥新發(fā)病率的首位[1]。由于前列腺癌與雄激素相關(guān)的特性，激素剝奪性治療（androgen deprivation therapy, ADT）被認為是前列腺癌有效的治療手段[2-4]。但大多數(shù)病例最終將發(fā)展成為激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer, AIPC）而對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生抵抗，繼而出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡。

第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatease and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）屬于抑癌基因，其表達水平降低或丟失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5]。雄激素受體（androgen receptor, AR）是AIPC發(fā)生發(fā)展進程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，并接受多種調(diào)控因子的共同作用而產(chǎn)生生物效應(yīng)[6]。在前列腺癌細胞中，PTEN可以通過負調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響AR的表達[7,8]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信號通路是真核細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的重要途徑之一，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。MAPK信號通路由3類蛋白激酶（Raf-MEK-ERK）組成，通過一次磷酸化將上游信號傳遞到下游應(yīng)答分子。最近有研究證明MAPK信號通路的激活與AIPC的病程進展也存在相關(guān)性[9]。然而，PTEN是否與該通路存在關(guān)系還不確定。本研究旨在探討PTEN是否與MAPK信號通路中Raf1的磷酸化存在關(guān)系，為前列腺癌的臨床診治應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

前列腺癌PC-3細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫；PTEN-pCMV6載體購自美國Origene公司；si-PTEN RNA購自Qiagen公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX Reagent和Opti-MEM I Medium培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；兔抗PTEN，山羊抗Raf-1和兔抗β-actin抗體購自Santa cruz公司，小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG購自美國KPL公司；胎牛血清購自Gibco公司。

二、細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、10 ng/ml EGF和青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，PC-3細胞在37℃，5% CO2恒溫箱培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3d更換培養(yǎng)液，胰酶消化傳代。取對數(shù)期細胞用于實驗。

三、細胞的瞬時轉(zhuǎn)染

在24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 ml對數(shù)期細胞懸液（1×105個/孔），過夜培養(yǎng)備用。8μg PTEN-pCMV6載體質(zhì)粒和10μl的Lipofectamine 2000分別用250μl的Opti-MEM稀釋，放置5min后混勻，在室溫放置25min后加入到細胞培養(yǎng)板中，6h后換成完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48h后用Western Blot檢測PTEN基因過表達程度。并檢測Raf-1的磷酸化水平。用空質(zhì)粒做對照。

四、細胞的干擾

在24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 ml對數(shù)期細胞懸液（2×105個/孔），過夜培養(yǎng)備用。0.7μl的20 μM si-PTEN RNA及1μl Lipofectamine RNAiMAX分別用5μl的Opti-MEM稀釋放置5min后混勻，在室溫放置18min后加入到24孔板中并加200μl的opti-MEM，6h后換成含完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48h后用Western Blot檢測PTEN基因干擾程度。并檢測Raf-1的磷酸化水平。用control siRNA做對照。

五、Western blot檢測

各轉(zhuǎn)染組細胞用胰酶消化后，加入細胞裂解液裂解并離心提取蛋白質(zhì)，Bio-rad蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。等量的總蛋白經(jīng)煮沸變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%奶粉溶液封閉2h，一抗（兔抗PTEN、山羊抗Raf-1和兔抗β-actin抗體）孵育過夜，二抗（小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG）孵育4h，滴加適量ECL化學(xué)發(fā)光底物，顯影。采用Quantity One軟件測定條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用配對樣本分析方法，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、過表達PTEN對Raf-1磷酸化的影響

Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PTEN-pCMV6載體質(zhì)粒進入PC-3細胞之后，用Western blot技術(shù)測定PTEN和磷酸化Raf-1的水平，以測定轉(zhuǎn)染效果和PTEN過表達對Raf-1磷酸化的影響。結(jié)果表明，PTEN過表達后磷酸化Raf-1明顯減少（圖1）?；叶确治霰砻?，過表達后磷酸化Raf-1減少61.1%（表1）。

表1 過表達PTEN對Raf-1影響的Western 條帶灰度值比較（n=3）

圖1 過表達PTEN對Raf-1磷酸化的影響

二、干擾PTEN對Raf-1磷酸化的影響

Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染si-PTEN干擾RNA進入PC-3細胞之后，用Western blot技術(shù)測定PTEN和磷酸化Raf-1的水平，以測定PTEN干擾效果和干擾后對Raf-1磷酸化的影響。結(jié)果表明，干擾PTEN后磷酸化Raf-1明顯增加（圖2）?；叶确治霰砻鳎蓴_PTEN后磷酸化Raf-1增加75.1%（表2）。認與AR異常表達有關(guān)。PTEN是一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23，其編碼蛋白具有磷酸酪氨酸酶和雙重特異性磷酸酶結(jié)構(gòu)域，能使某些磷脂或蛋白激酶的相應(yīng)位點去磷酸化，對細胞周期、細胞凋亡以及細胞的粘附、遷移和分化產(chǎn)生影響[12]。PTEN表達水平降低或丟失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，PTEN基因的失活是前列腺癌最常見的異常之一[13]。PTEN基因功能的缺失可能是AIPC進展的關(guān)鍵原因[14-16]。PTEN功能缺失可阻止PI3K/AKT通路中PIP3脫磷酸轉(zhuǎn)化為PIP2，從而使AKT持續(xù)激活，提高磷酸化AKT水平，繼而調(diào)控AR的生物效應(yīng)，并抑制通路下游凋亡的信號分子，促進細胞的增殖[17]。

MAPK/ERK也是前列腺癌發(fā)病機制中的重要信號傳導(dǎo)通路之一。PI3K/AKT信號通路主要與細胞的存活相關(guān)，而MAPK/ERK則主要與細胞生長、增殖和分化有關(guān)[18,19]。MAPK/ERK信號通路的激活始于細胞膜上的絲裂原受體激活，以高度保守的三級激酶級聯(lián)傳遞信號，MAPK以及多種應(yīng)激原可以不同的啟動機制激活該信號通路。MAPK/ERK信號通路中Raf分為A-raf、B-raf和C-raf-1，其中C-raf-1表達產(chǎn)物為Raf1蛋白激酶，其CR1保守區(qū)即為活化Ras的結(jié)合部位。Ras作為通路的啟動信號，其激活后可將Raf1聚集到細胞膜并結(jié)合其他相關(guān)蛋白導(dǎo)致Raf1的磷酸化，磷酸化的Raf1通過其下游因子MAPK激酶（MEK1/2）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）完成胞漿蛋白磷酸化、細胞骨架成分磷酸化以及胞核轉(zhuǎn)錄因子、核蛋白磷酸化等而實現(xiàn)其生物效應(yīng)。在前列腺癌，Ras和Raf的激活是自分泌和旁分泌生長因子刺激的結(jié)果，Ras持續(xù)激活可推進AIPC的病程進展[13]，MAPK/ERK信號通路在前列腺癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[20]。

PTEN是否與MAPK/ERK信號通路存在聯(lián)系是本研究想要探討的問題。磷酸化Raf1是MAPK/ ERK信號通路中三級級聯(lián)反應(yīng)的第一級，起著分子開關(guān)的作用，是聯(lián)系細胞外信號與細胞內(nèi)激酶級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵之一。本實驗結(jié)果提示PTEN基因表達與前列腺癌PC-3細胞Raf-1磷酸化呈負相關(guān)關(guān)系，有助于揭示前列腺癌的發(fā)生機制并可針對PTEN、Raf1以及MEK等信號通路中關(guān)鍵因子作為靶點進行治療干預(yù)。PTEN蛋白對Raf1磷酸化的具體作用機制以及磷酸化Raf1對AIPC有何影響，有待進一步研究。

圖2 干擾PTEN對Raf-1磷酸化的影響

表2 干擾PTEN對Raf-1影響的Western條帶灰度值比較（n=3）

討 論

前列腺癌是近年老年男性發(fā)病率較高的癌癥之一，對前列腺癌的發(fā)病機制及其治療手段研究也是當前癌癥研究領(lǐng)域的熱點。絕大多數(shù)早期前列腺癌都與雄激素的異常表達有關(guān)，因此，早期前列腺癌治療多用抗雄激素治療的方法[10]。然而，大量前列腺癌后期都表現(xiàn)為激素非依賴性（即AIPC），導(dǎo)致抗雄激素治療無效。

AIPC發(fā)病機制尚待研究，AR在其細胞增殖、分化以及發(fā)生發(fā)展中的重要作用備受關(guān)注。作為核轉(zhuǎn)錄因子，AR結(jié)合相關(guān)配體可激活一系列活性蛋白轉(zhuǎn)錄參與細胞的增殖、凋亡等。大多數(shù)AIPC表現(xiàn)有AR的擴增或過表達，繼而導(dǎo)致對低水平雄激素的敏感性增加，或經(jīng)由AR傳遞的信號通路激活，可能是AIPC產(chǎn)生的機制之一[11]。

酪氨酸激酶受體通路是眾多與AR信號通路發(fā)生交互作用的信號通路之一，主要包括PI3K/AKT和MAPK/ERK等。其中PI3K/AKT信號通路已經(jīng)被確

1 Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer Statistics, 2012. Ca-Cancer J Clin 2012; 62(1): 10-29

2 Chen CD, Welsbie DS, Tran C, et al. Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy. Nat Med 2004; 10(1): 33-39

3 Waltering KK, Urbanucci A, Visakorpi T. Androgen receptor (AR) aberrations in castration-resistant prostate cancer. Mol Cell Endocrinol 2012; 360 (1-2): 38-43

4 Lonergan PE, Tindall DJ. Androgen receptor signaling in prostate cancer development and progression. J Carcinog 2011; 10: 20

5 To MD, Perez-Losada J, Mao JH, et al. Crosstalk between Pten and Ras signaling pathways in tumor development. Cell Cycle 2005; 4(9): 1185-1188

6 Shafi AA, Yen AE, Weigel NL. Androgen receptors in hormone-dependent and castration-resistant prostate cancer. Pharmacol Ther 2013; 140(3): 223-238

7 Carver BS, Chapinski C, Wongvipat J, et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-defi cient prostate cancer. Cancer Cell 2011; 19 (5): 575-586

8 Reddy GP, Barrack ER, Dou QP, et al. Regulatory processes affecting androgen receptor expression, stability, and function: potential targets to treat hormone-refractory prostate cancer. J Cell Biochem 2006; 98 (6): 1408-1423

9 Dong JT. Prevalent mutations in prostate cancer. J Cell Biochem 2006; 97(3): 433-447

10 Pan J, Chen J, Zhang B, et al. Association between RASSF1A promoter methylation and prostate cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS One 2013; 8(9): e75283

11 Bluemn EG, Nelson PS. The androgen/androgen receptor axis in prostate cancer. Curr Opin Oncol 2012; 24 (3): 251-257

12 Conde-Perez A, Larue L. PTEN and melanomagenesis. Future Oncol 2012; 8(9): 1109-1120

13 Taylor BS, Schultz N, Hieronymus H, et al. Integrative genomic profiling of human prostate cancer. Cancer Cell 2010; 18(1): 11-22

14 Mulholland DJ, Tran LM, Li Y, et al. Cell autonomous role of PTEN in regulating castration-resistant prostate cancer growth. Cancer Cell 2011; 19(6): 792-804

15 Carver BS, Chapinski C, Wongvipat J, et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell 2011; 19(5): 575-586

16 He L, Fan C, Kapoor A, et al. α-Mannosidase 2C1 attenuates PTEN function in prostate cancer cells. Nat Commun 2011; 2: 307

17 Carnero A, Blanco-Aparicio C, Renner O, et al. The PTEN/PI3K/AKT signalling pathway in cancer, therapeutic implications. Curr Cancer Drug Targets 2008; 8(3):187-198

18 Lee K, Song K. Actin dysfunction activates ERK1/2 and delays entry into mitosis in mammalian cells. Cell Cycle 2007; 6 (12): 1487-1495

19 Pimienta G, Pascual J. Canonical and alternative MAPK signaling. Cell Cycle 2007; 6 (21): 2628-2632

20 Mulholland DJ, Kobayashi N, Ruscetti M, et al. Pten loss and RAS/MAPK activation cooperate to promote EMT and metastasis initiated from prostate cancer stem/ progenitor cells. Cancer Res 2012; 72(7): 1878-1889

（2013-11-11收稿）

PTEN downregulates in the level of Raf-1 phosphorylation in prostate cancer cell PC-3

Sun Jianwei1, Wang Jiansong1*, Liu zichao2, Yang Junfeng1, Ma Hui1, Zheng Limin3
1.Department of Urology, the Second Affi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101, China; 2. Department of Biologican Science and Technology, Kunming University; 3. Department of Urology, the Fifth Affi liated Hospital of Kunming Medical University Corresponding author: Wang Jiansong, E-mail: Jiansongwang@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the effects of PTEN expression on level of Raf-1 phosphorylation in prostate cancer cells.MethodsThe level of Raf-1 phosphorylation was detected by western blot in prostate cancer cells with PTEN gene overexpression or PTEN gene knockdown.ResultsThe level of Raf-1 phosphorylation decreased by 61.1% in PC-3 cells with PTEN gene overexpression, and increased by 75.1% in PC-3 with PTEN gene silence.ConclusionPTEN can downregulate the level of Raf-1 phosphorylation.

PTEN Phosphohydrolase; Raf Kinases; prostatic neoplasms

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.005

R 737.25

*通訊作者, E-mail: Jiansongwang@yahoo.com