劉艷波孫媛媛徐 杰焦 橋費(fèi)聰聰趙曉暉蘆麗莉**董 妍趙雪儉

1. 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（吉林 132013）; 2. 吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心; 3. 美國(guó)杜蘭大學(xué)生命科學(xué)研究中心

甲基硒酸對(duì)前列腺癌Lncap細(xì)胞的促凋亡作用*

劉艷波1,2孫媛媛1徐 杰1焦 橋1費(fèi)聰聰1趙曉暉1蘆麗莉1**董 妍2,3**趙雪儉2

1. 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（吉林 132013）; 2. 吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心; 3. 美國(guó)杜蘭大學(xué)生命科學(xué)研究中心

目的探討甲基硒酸（methylseleninic acid，MSA）對(duì)前列腺癌Lncap細(xì)胞促凋亡效應(yīng)，并初步探討發(fā)生機(jī)制。方法 將體外培養(yǎng)的Lncap細(xì)胞分為4組，即空白對(duì)照組（mock），MSA低劑量組（1.25μM）、中劑量組（2.50μM）和高劑量組（5.00μM），MSA分別作用24h、48h和72h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，SRB法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡；免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)stat3的表達(dá)。結(jié)果光鏡及SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨MSA劑量增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，Lncap細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明：MSA呈劑量及時(shí)間依賴關(guān)系促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，多數(shù)細(xì)胞被阻滯于G0～G1期；免疫熒光及免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，MSA可明顯抑制細(xì)胞內(nèi)stat3表達(dá)。結(jié)論MSA抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其發(fā)生機(jī)制可能與降低stat3表達(dá)，進(jìn)而抑制下游增殖基因表達(dá)有關(guān)。

前列腺癌; 甲基硒酸; 細(xì)胞凋亡; stat3轉(zhuǎn)錄因子

硒是人體必需的微量元素，具有廣泛的生物學(xué)功能，如含硒蛋白質(zhì)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和硫氧蛋白還原酶，是細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的重要調(diào)節(jié)劑，對(duì)維持細(xì)胞功能意義重大[1]。此外，硒具有降低前列腺癌發(fā)病的作用，如成年男性每天補(bǔ)充200μg的硒可使前列腺癌的發(fā)病危險(xiǎn)性降低50%[2]。但硒抗癌活性取決于化學(xué)構(gòu)成，一般來(lái)講，無(wú)機(jī)硒化合物如硒酸鹽或亞硒酸鹽可損害DNA，造成遺傳毒性，臨床應(yīng)用受到較大限制；有機(jī)硒化合物根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)不同其抗癌活性也差異較大[3,4]；較穩(wěn)定的硒前體化合物如甲基硒酸（methylselenic acid，MSA）在體內(nèi)可迅速被代謝成具有抗癌活性的甲基硒（methylselenol），能抑制激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究在此基礎(chǔ)上探討MSA對(duì)激素依賴性前列腺癌細(xì)胞Lncap的作用及相關(guān)機(jī)制，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

（一）實(shí)驗(yàn)試劑

Lncap細(xì)胞株由吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心饋贈(zèng)，MSA為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，由美國(guó)杜蘭大學(xué)張海濤博士惠贈(zèng)；胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；小鼠抗人stat3抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，山羊抗小鼠IgG二抗（紅熒光CY3標(biāo)記）購(gòu)自sigma公司，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司，DAB購(gòu)自北京中杉試劑公司、其它常規(guī)化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；熒光顯微鏡（Olympus，日本）；超凈工作臺(tái)（YZ-875蘇州凈化設(shè)備廠）；自動(dòng)CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO，日本）；自動(dòng)高壓蒸氣消毒器（SONY，日本）；低溫冰箱（-80℃ SANYO，日本）； 恒溫水浴箱（江蘇常州國(guó)華儀器廠）；紫外分光光度計(jì)及分析工作站（島津Shimadazi，日本）；加樣器（JECONS，芬蘭）等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

前列腺癌細(xì)胞株Lncap 1×106分別接種在100ml培養(yǎng)瓶中，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃，5% CO2培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合，分組給藥。

（二）細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)-SRB（sulforhodamine B，SRB）法

將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105/ml后接種于96孔平底培養(yǎng)板，每孔100μl（2×104/孔）。分為mock組，MSA給藥組（MSA1.25、2.50和5.00μM），每組設(shè)4復(fù)孔，待細(xì)胞達(dá)到70%左右融合時(shí)，分組給藥，并設(shè)24h，48h，72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。培養(yǎng)至48h時(shí)在相差顯微鏡下觀察拍照后；每孔輕柔加入50μl經(jīng)4℃預(yù)冷的500ml/L三氯醋酸，置4℃1 h，自來(lái)水洗5次，空氣干燥后，加4 g/L SRB染色15～30 min，用醋酸洗滌5遍，干燥后，加入10mmol/L Tris液100μl溶解，微振器上振蕩10min，在酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)波長(zhǎng)570nm光的吸光度(A)值。按公式抑制率%=（對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值）/對(duì)照組A均值×100%計(jì)算各組抑制率，抑制率＞30%即對(duì)該藥敏感性高。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（三）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Lncap細(xì)胞分為4組，加藥48h后，收集細(xì)胞后離心， 70% 冷乙醇中4℃固定12h。PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，用RNase消化后，加入1.5ml PI（5mg/100ml）對(duì)DNA進(jìn)行染色，混勻后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行單參數(shù)分析。

（四）免疫熒光染色

將大小合適的蓋玻片置于12孔板內(nèi)，各組細(xì)胞于加藥48h后PBS洗一次；用新鮮配制的4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，PBS洗5次，0.2% TritonX-100打孔，1%BSA室溫封閉10min；滴加磷酸化Stat3多克隆抗體（1:300，由1%PBS BSA配制）室溫孵育2h；2.7%NaCl洗2×5min； PBS清洗2×5min；滴加CY3標(biāo)記的熒光二抗（1:20由1%PBS BSA配制）避光室溫孵育細(xì)胞1h，熒光顯微鏡下觀察stat3在各組細(xì)胞中的分布，拍照。

（五）免疫細(xì)胞化學(xué)染色

將大小適合的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞為5×105/孔，37℃，5%CO2中培養(yǎng)，次日加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48h，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.2% TritonX-100打孔，免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察細(xì)胞內(nèi)stat3表達(dá)情況。

結(jié) 果

一、相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，狀況良好，多為長(zhǎng)梭形，可見(jiàn)聚集現(xiàn)象，核仁清晰，可見(jiàn)核分裂相，細(xì)胞折光性好，增殖旺盛，漂浮細(xì)胞少見(jiàn)；MSA組隨劑量增加及給藥時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，顆粒增多，可見(jiàn)細(xì)胞碎片和漂浮細(xì)胞；部分細(xì)胞失去原有形態(tài)，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，見(jiàn)圖1

圖1 MSA作用于Lncap細(xì)胞48h后細(xì)胞形態(tài)（×200）A: mock B :1.25μM MSA C: 2.50 μM MSA D: 5.00μM MSA

二、MSA對(duì)Lncap細(xì)胞增殖抑制作用（SRB法）

利用SRB法檢測(cè)不同濃度的MSA對(duì)Lncap細(xì)胞增殖抑制作用。分別于給藥后24h、48h及72h后進(jìn)行檢測(cè)，以mock組增殖抑制率為0%，則1.25μM MSA組細(xì)胞增殖抑制率分別為1.24%，5.36%和9.21%；2.50μM MSA組細(xì)胞增殖抑制率分別為9.23%，21.62%和39.42%；5.00μM MSA組細(xì)胞增殖率分別為18.36%，30.67%和65.32%。抑制率表現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系（表1

表1 MSA對(duì)前列腺癌Lncap細(xì)胞增殖的影響（±s，n=4）

表1 MSA對(duì)前列腺癌Lncap細(xì)胞增殖的影響（±s，n=4）

*: 與對(duì)應(yīng)的mock組比較，P＜0.05;#: 與對(duì)應(yīng)的1.25μM MSA值比較，P＜0.05

?

三、MSA對(duì)Lncap細(xì)胞凋亡的影響

收集MSA作用后48h的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)。結(jié)果表明：與mock組相比，Lncap細(xì)胞經(jīng)1.25μM、2.50μM、5.00μM MSA處理后，均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，其凋亡率分別為14.7%， 33.1%，52.8%，表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系，其凋亡率和細(xì)胞周期分析見(jiàn)表2

表2 MSA對(duì)前列腺癌Lncap細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響

四、MSA對(duì)stat3表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：mock組細(xì)胞stat3主要表達(dá)在胞漿，細(xì)胞核內(nèi)也可見(jiàn)紅色熒光；MSA給藥組Lnca細(xì)胞胞漿中紅色熒光表達(dá)明顯減少，即5.00μM MSA可降低stat3表達(dá)（圖2）。為了進(jìn)一步證實(shí)MSA降低細(xì)胞內(nèi)stat3的表達(dá)，又通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)染色法進(jìn)行檢測(cè)，DAB染色發(fā)現(xiàn)：mock組stat3蛋白表達(dá)明顯高于5.00μM MSA組；stat3蛋白表達(dá)的陽(yáng)性顆粒主要位于Lncap細(xì)胞胞漿，也有少部分位于胞核內(nèi)（圖3）。stat3免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果相吻合。

圖2 MSA對(duì)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)stat3表達(dá)的影響（×200）

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)MSA對(duì)細(xì)胞內(nèi)stat3表達(dá)的影響（×200）

討 論

前列腺癌發(fā)病率在美國(guó)中老年男性惡性腫瘤中居首位，死亡率位于第二位。因此前列腺癌的防治一直是泌尿生殖系統(tǒng)熱點(diǎn)問(wèn)題。有大量的研究表明，含硒化合物具有預(yù)防及治療前列腺癌作用，但治療效果取決于硒的化學(xué)組成。MSA作為有機(jī)硒的前體，可代謝為低毒甚至無(wú)毒的含硒物質(zhì)，可干擾雄激素受體（androgen receptor，AR）啟動(dòng)子的活性，并呈現(xiàn)出時(shí)間及劑量關(guān)系[5-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MSA低、中、高劑量組均可抑制細(xì)胞增殖，隨時(shí)間延長(zhǎng)及劑量增加對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)。Dong等[6]研究發(fā)現(xiàn)， MSA能以劑量及時(shí)間依賴性的方式抑制PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)并介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，利用基因芯片鑒定出了MSA作用后變化較為明顯的14個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)MSA介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯可能是通過(guò)上調(diào)p19INK4d和p2lwAF1基因，以及下調(diào)CDK1，CDK2和cyclinA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Zhao等[8]將MSA加入Lncap細(xì)胞培養(yǎng)液中，利用基因芯片發(fā)現(xiàn)MSA作用于細(xì)胞后，多種細(xì)胞周期調(diào)控基因的mRNA表達(dá)水平發(fā)生了劇烈變化，同時(shí)細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞大量積聚在G0/G1期，并且發(fā)現(xiàn)MSA還可以調(diào)節(jié)雄激素調(diào)控基因的表達(dá)，抑制雄激素受體的表達(dá)并降低PSA的分泌量。

為了證實(shí)MSA促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)是否與stat3的表達(dá)改變有關(guān)，本研究通過(guò)熒光免疫及細(xì)胞免疫染色法觀察了細(xì)胞內(nèi)stat3的表達(dá)情況。stat3是stat家族重要的信號(hào)蛋白之一，在相應(yīng)配體刺激下，stat3第Y705位酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，以二聚體形式轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并與相應(yīng)DNA反應(yīng)元件結(jié)合，刺激下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖及新生血管生成等。在許多腫瘤（包括前列腺癌）發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，stat3持續(xù)激活，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡減少、增殖迅速、腫瘤內(nèi)血管密度增加、產(chǎn)生耐藥效應(yīng)，腫瘤存活時(shí)間延長(zhǎng)[9-11]。有研究證實(shí)：硒化合物可抑制腫瘤細(xì)胞stat3的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制下游基因VEGF表達(dá)，表現(xiàn)出促凋亡及抗增殖活性[12]。本研究利用免疫熒光染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)了stat3在Lncap細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果表明：mock組stat3表達(dá)明顯增加，stat3主要位于細(xì)胞漿，少量位于細(xì)胞核，5.00μM MSA作用細(xì)胞48h后，熒光及組化染色較對(duì)照組比較明顯降低，說(shuō)明MSA可降低前列腺癌細(xì)胞內(nèi)stat3的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體通路還有待于進(jìn)一步探討。

由此可見(jiàn)，MSA體外對(duì)激素依賴性前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制效應(yīng)，與抑制stat3的表達(dá)關(guān)系密切，為體內(nèi)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（2013-07-17收稿）

Methylseleninic acid promotes prostatic cancer LNCap cells apoptosis*

Liu Yanbo1,2, Sun Yuanyuan1, Xu Jie1, Jiao Qiao1, Fei Congcong1, Zhao Xiaohui1, Lu Lili1**, Dong Yan2,3**, Zhao Xuejian2
1. Beihua University Medical College, Jilin 132013, China; 2. Prostate Disease Prevention and Cure Research Center, Jilin University; 3. Tulane University Life Science Research Center, Louisiana USA Corresponding author:Lu Lili, E-mial: lulili313@163.com; Dong Yan, E-mail: drdong71@gmail.com

ObjectiveTo investigate the proapoptotic effects of methylseleninic acid (MSA) on prostatic cancer Lncap cells and explore its mechanism.MethodsThe treated Lncap cells were divided into four groups such as the control group (mock), MSA low-dose group (1.25μM), middle dose group (2.50μM) and high dose group (5.00μM) respectively. Cell morphology was observed with microscope at the time of 24h, 48h and 72h after treatment. Cell proliferation was detected by SRB assay. Cell cycle and apoptosis was measured by flow cytometry. Stat3 expression was detected by immunofl uorescence and immunocytochemical analysis.ResultsLight microscopy observation and SRB results indicated that the growth of Lncap cells were inhibited obviously with MSA dose and time dependent effect. Flow cytometry analysis showed that MSA promoted LNCap cells apoptosis with dose and time dependent effect and changed the cell cycle distribution. The majority of cells were arrested in G0-G1 phase. Immunofl uorescence and immunohistochemistry results showed MSA could inhibit the expression of intracellular stat3 compared with that of the control group.Conclusion MSA might inhibit cell proliferation and induce apoptosis, and its mechanism was associated with decreased stat3 expression.

prostatic neoplasms; methylseleninic acid; apoptosis; stat3 transcription factor

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.003

R 737.25

資助: 國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào): 20121020103）;吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目合同書(shū)（基教科合字2013191）

**共同通訊作者: 蘆麗莉, E-mial: lulili313@163.com; 董妍,E-mail: drdong71@gmail.com