彭 亮吳 昕馬 強賈韶彤景萬紅陽清虎劉春蓮**

1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗中心（銀川 750004）;

2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心; 3. 寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室

Y染色體長度異常與精子凋亡和生殖結(jié)局相關(guān)性研究*

彭 亮1,3吳 昕2,3馬 強1,3賈韶彤2,3景萬紅2,3陽清虎2,3劉春蓮2,3**

1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗中心（銀川 750004）;

2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心; 3. 寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室

目的探討輔助生殖技術(shù)過程中，Y染色體長度異常的影響機制，分析Y染色體長度異常與精子凋亡和生殖結(jié)局的相關(guān)性。方法將研究對象分為A組（大Y組），B組（小Y組）以及C組（對照組），分別為28例、16例及30例。采用磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（Propidium iodide, PI）精子染色，通過流式細胞儀（FCM）檢測精子亞群所占的比例。結(jié)果（1）男性年齡、精液量、密度、活率以及AN-/PI-在3組中分布無差異；B組與C組相比，AN+/PI-和AN/PI+有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；（2）以AN+/PI-值為20%分組，A，B，C組受精率、臨床妊娠率以及早期胚胎丟失率在2組中均無統(tǒng)計學差異；但AN+/PI-≥20%，B組與C組相比，臨床妊娠率有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結(jié)論 大Y染色體與精子凋亡無明顯相關(guān)性，小Y可能與精子凋亡相關(guān)并影響生殖結(jié)局。

染色體, 人, Y; 精子; 細胞凋亡; 生殖結(jié)局

Y染色體長度異常包括大Y和小Y，是最為常見的男性染色體變異。目前研究的熱點集中在其與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性[1,2]，但Y染色體長度變異是否影響到精子遺傳物質(zhì)，進而出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，目前尚無此方面的相關(guān)研究。本研究利用磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI ）雙染法對在我中心接受體外受精-胚胎培養(yǎng)（IVF-ET）技術(shù)的Y染色體長度異?；颊邫z測其精子DNA損傷程度，分析Y染色體長度變異與精子DNA損傷的相關(guān)性。

對象和方法

一、研究對象

選擇2011年11月至2012年9月在本院生殖醫(yī)學中心就診的74例男性患者，其中大Y28 例，小Y 16例，染色體正常對照30例， 排除標準：（1）排除多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢功能低下等干擾因素；（2）每名女性取卵數(shù)≤5枚；（3）無精子癥。

二、方法

（一）精液常規(guī)及形態(tài)學檢查

研究對象禁欲2～5d，通過手淫法收集精液于無菌取精杯后，置37℃下完全液化，遵照WHO（5版）技術(shù)規(guī)范，利用計算機輔助精子動態(tài)圖像檢測系統(tǒng)（Computer-assisted semen analysis, CASA）檢測。取5～10μl精液，采用拉薄制片法涂片，利用巴氏染色方法行精液形態(tài)學分析。

（二）染色體核型分析

采用外周血淋巴細胞培養(yǎng)，常規(guī)制備染色體標本，G顯帶分析。分別以Y染色體≥18號染色體，Y染色體≤21號染色體作為大Y和小Y染色體的標準。

（三） IVF /ICSI-ET 助孕

嚴格按照寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心臨床操作手冊執(zhí)行。包括控制性超排卵、采卵、體外受精與移植過程，移植后14 d 行血人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，HCG）檢查，陽性者在4 周后行B 超檢測，孕囊存在為臨床妊娠。

（四）Annexin V/PI 雙染法

按照 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司，南京）操作說明進行。將精子懸液用PBS洗滌細胞2次（2000rpm離心5min）收集1～5×105細胞, 加入500μl的Bingding Buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5μl PI溶液混勻，避光孵育15 min。

（五）FCM檢測

流式細胞儀器（Flow Cytometer，F(xiàn)CM）檢測，激發(fā)波長Ex=488nm，發(fā)射波長Em=530nm。樣本均獲取10 000 個精子, 數(shù)據(jù)用Cell Quest軟件分析。

三、統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，組間均數(shù)比較偏態(tài)分布采用秩和檢驗，正態(tài)分布采用t檢驗，組間率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

本項研究得到了本院生殖醫(yī)學倫理委員會的批準。

結(jié) 果

一、Annexin V/PI雙染后經(jīng)FCM檢測質(zhì)膜PS外翻結(jié)果

由圖1可見，左下象限是活的、未凋亡精子，為Annexin及PI陰性（AN-/PI-）；右下象限是PS外翻精子，為Annexin陽性、PI陰性（AN+/ PI-）；右上/左上象限為壞死精子PI陽性（AN/PI+）。

圖1 Annexin V/PI雙染后經(jīng)FCM檢測質(zhì)膜PS外翻結(jié)果

二、3組Annexin V/PI雙染法精子凋亡情況與精液常規(guī)比較

將研究對象分為A組（大Y組），B組（小Y組）及C組（對照組），分別為28例、16例及30例。 三組Annexin V/PI雙染法精子凋亡情況與精液常規(guī)比較見表1。

表1 3組Annexin V/PI雙染法精子凋亡情況與精液常規(guī)比較

三、精子DNA損傷與IVF-ET妊娠結(jié)局的相關(guān)性

以AN+/PI-值為20%分界，對比三組的受精率、臨床妊娠率以及早期胚胎丟失率，見表2。

表2 以AN+/PI-值為20%分界三組妊娠結(jié)局的比較

討 論

Y染色體長度異常是由異染色質(zhì)區(qū)的DNA過多重復或缺失所致，1978年Nielsen報道Yq+（大Y）與流產(chǎn)呈正相關(guān)[3]，其臨床表現(xiàn)差異較大，評價指標亦局限于精液常規(guī)指標和形態(tài)學分析，而大Y 和小Y是否會影響到精子 DNA損傷進而出現(xiàn)臨床癥狀尚無相關(guān)報道。Oleszczuk等以精子碎片化指數(shù)（DFI）為30%分界，檢測個體間的DFI波動情況，證實85%變化在同一個區(qū)間內(nèi)[4]。因此檢測DNA損傷情況具有絕對的穩(wěn)定性。DNA損傷是由于精子染色質(zhì)包裝異常、高活性氧反應(yīng)以及凋亡3大因素造成[5]。

本研究采用Annexin V/PI雙染經(jīng)FCM檢測，將精子分為正常精子，早期凋亡精子和壞死精子。Annexin V是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS 有高度親和力，早期凋亡精子存在質(zhì)膜PS外翻，Annexin V 能與其結(jié)合，這時膜尚未破裂，PI染料不能進入細胞內(nèi)部，為PI-；活的、未凋亡的精子為Annexin V-/PI-； 壞死精子或者處理過程中質(zhì)膜破壞的精子為PI+。

本研究數(shù)據(jù)顯示3組精液量、密度和活力沒有統(tǒng)計學差異，小Y組AN+/PI-所占比例高于大Y組和對照組中，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），進一步分析發(fā)現(xiàn)小Y組中有2例精液常規(guī)參數(shù)和形態(tài)均正常，但AN+/ PI-均高于30%。Jonathan等對Y染色體長臂缺失的小鼠研究，發(fā)現(xiàn)其與異常染色質(zhì)包裝和精子DNA損傷呈正相關(guān)[6]。本研究通過Annexin V-/PI-值為20%進行分組，比較受精率、臨床妊娠率以及胚胎丟失率在3組中的分布差異。AN+/PI-值≥20%，小Y組與對照組相比，臨床妊娠率具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。Lynne等對16項研究（2969對夫婦）進行Meta分析，DNA損傷與流產(chǎn)存在明顯的正相關(guān)（RR= 2.16，P＜0.00）[7]。DNA精子損傷可能并不影響受精過程，但阻止囊胚形成或胚胎順利發(fā)育，在囊胚發(fā)育時期，胚胎基因組激活，轉(zhuǎn)錄活性開始，父性效應(yīng)在胚胎發(fā)育到4～8細胞期發(fā)揮作用，因此在這一時期，父性DNA誘導的改變很明顯，損害胚胎的發(fā)育。在IVF中，在高DNA損傷和低DNA損傷的患者中，臨床妊娠率沒有區(qū)別，因為這是一種自然地精子選擇過程，精子形態(tài)異常，活力差和DNA損傷，有很低的受精率。這種觀點被之前的研究證實，透明帶可能有識別精子異常物質(zhì)損傷的功能。一項對28個精子DNA損傷與IVF/ICSI相關(guān)性研究綜述表明，DNA損傷對ICSI妊娠結(jié)局的影響高于IVF[8]。本研究中AN+/PI-≥20%組中，3組早期胚胎流產(chǎn)率均高于AN+/PI-＜20%組，但無統(tǒng)計學差異，這可能與研究樣本例數(shù)有關(guān)。Bronet等研究認為精子DNA損傷指數(shù)與胚胎非整倍體無相關(guān)性，在習慣性流產(chǎn)和種植失敗的患者，不同的監(jiān)測方式得到的結(jié)果不同[9]。

今后的研究將不斷收集染色體長度異常病例資料，更加客觀的評價其臨床效應(yīng)，同時有必要從分子水平進一步研究DNA損傷的機制，和抗氧化治療的潛在效果，為治療男性不育癥以及不明原因不育提供診斷和治療依據(jù)。

1 Minocherhomji S,Athalye AS, Madon PF,et al.A casecontrol study identifying chromosomal polymorphic variations as forms of epigenetic alterations associated with the infertility phenotype.Fertil Steril2009; 92(1): 88-95

2 Sakkas D, Alvarez JG. Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis.Fertil Steril2010; 93(4): 1027-1036.

3 Nielsen J. Chromosome (Yq+) and increased risk of abortion.Clin Genet1978; 13(5): 415-416

4 Oleszczuk K, Giwercman A, Bungum M. Intra-individualvariation of the sperm chromatin structure assay DNA fragmentation index in men from infertile couples.Hum Reprod2011; 26(12): 3244-3248

5 Aitken RJ, de Iuliis GN. On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa.Mol Hum Rep2010; 16(1): 3-13

6 Lynne R, Ioannis DG, Sarah JC,et al. Def ciency of the multi-copy mouse Y gene Sly causes sperm DNA damage and abnormal chromatin packaging.J Cell Sci2013; 126(Pt 3): 803-813

7 Lynne R, Ioannis DG, Sarah JC,et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis.Hum Reprod2012; 27(10): 2908-2917

8 Zini A, Jamal W, Cowan L,et al.Is sperm DNA damage associated with IVF embryo quality? A systematic review.J Assist Reprod Genet2011; 28(5): 391-397

9 Bronet F, Martínez E, Gaytán M,et al. Sperm DNA fragmentation index does not correlate with the sperm or embryo aneuploidy rate in recurrent miscarriage or implantation failure patients.Hum Reprod2012; 27(7): 1922 -1929

（2013-12-12收稿）

The relationship of abnormal lengthy Y chromosome with sperm apoptosis and reproductive outcome*

Peng Liang1,3, Wu Xin2,3, Ma Qiang1,3, Jia Shaotong2,3, Jing Wanhong2,3, Yang Qinghu2,3, Liu Chunlian2,3**
1. Experiment Center of Basic Medical College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 2.Center of Reproductive Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University; 3.Key Laboratory of Fertility
Maintenance,Ministry of Education,Ningxia Medical University

Liu Chunlian, E-mail: liucl1981@aliyun.com

ObjectiveTo explore the effects of abnormal lengthy Y chromosome on reproductive outcome and sperm apotosis and analyze their relationship.MethodsThe object of study were divided into three groups including Group A (big Y chromosome), Group B (small Y chromosome) and Group C (controls). DNA fragmentation was stained by Annexin V/PI assay,the results were analyze by f ow cytometry (FCM)to determine the ratio of AN-/PI-, AN+/ PI-and AN/PI+. Results (1)No signif cant differences were found in male age ,sperm volume, parameters and AN-/PI- among three groups;there were signif cant difference in AN+/PI-and AN/PI+between Group B and Goup C (P<0.05). (2)There was no changes in fertilization rate, clinical pregnancy rate and early pregnancy loss rate among three groups; however, for AN+/PI-≥20% ,implantation rate was signif cantly differece between group B and group C (P<0.05).ConclusionBig Y chromosome had no correlation with sperm apoptosis, while small Y chromosome may be related with sperm apoptosis and reproductive outcome.

Chromosomes, Human, Y; spermatozoa; apoptosis; reproductive outcome

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.007

R 321-33

資助: 寧夏自然科學基金面上項目（NZ11281）；寧夏醫(yī)科大學面上科研項目（XQ2011020）

**通訊作者, E-mail: liucl1981@aliyun.com