黃千貽 李慕軍江 莉 吳惠梅

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心（南寧 530021）

·研究簡報·

血小板活化因子和A23187對精子頂體反應(yīng)的影響

黃千貽 李慕軍*江 莉 吳惠梅

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心（南寧 530021）

頂體反應(yīng)（AR）是精子受精過程中的一個必要過程。在IVF或體內(nèi)自然受精過程中，精子的AR是由透明帶糖蛋白受體誘發(fā)的[1]，只有透明帶誘發(fā)的AR才具有重要生理意義。但是目前無法分離出足夠的此類物質(zhì)以常規(guī)測定精子頂體功能并應(yīng)用于診斷，所以需要研究天然AR激動劑的替代物及建立最佳誘導(dǎo)AR體系，這樣誘導(dǎo)的AR才更符合生理要求。已知大量的內(nèi)源性因子可以調(diào)節(jié)精子生育的潛能，其中包括血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）。有研究表明，PAF除有血小板激活功能外，其還能誘導(dǎo)動物精子體外獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)[2,3]。本實驗采取鈣離子載體（A23187）誘導(dǎo)人精子AR作為陽性對照組，以探討PAF對人精子AR的影響，為尋求天然AR激動劑的替代物及建立最佳誘導(dǎo)AR體系提供有力的理論依據(jù)，同時為不育癥的診治開辟一條新的途徑。

材料方法

一、試劑準(zhǔn)備

1. PAF貯存液：0.3mL PAF溶液稀釋于114mL氯仿和甲醇的混和液中（氯仿:甲醇為1:4），配成終濃度為10-5mol/L的溶液，分裝后儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2. FITC-PSA貯存液：2mgFITC-PSA溶于20mL PBS（pH值7.4），1mL分裝，4℃避光保存。

3. A23187：1mgA23187溶解于1mL DMSO中，配成終末濃度為1mg/mL溶液，少量分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆茫诉^程避光操作。

4. 熒光DNA粘合染料（Hoechst33258，H258）：取1mg溶于50mL PBS（pH值7.4）中，配成終末濃度為100μg/mL的溶液，分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

二、樣本和精液制備

32例為接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療患者，女方為繼發(fā)不孕患者，男方為健康且曾使女方懷孕患者，精液常規(guī)各項指標(biāo)均在正常范圍（符合WHO人類精液分析標(biāo)準(zhǔn)2001年）。取卵日當(dāng)天早上囑男方以手淫法獲取精液（禁欲2～7d），裝入無菌取精杯中，液化后進行精液常規(guī)分析。精液處理采用40%、80% percoll密度梯度離心法，三次離心后去部分表層，留至0.5mL精液，取部分上層液，加入ART-1020顯微鏡下調(diào)整密度2～5×106/mL至少2mL備用。將至少2mL已制備好的精子懸液放入37℃含有5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培育4h，使其獲能。

三、誘導(dǎo)頂體反應(yīng)和評估頂體狀態(tài)

PAF組取10μl PAF貯存液置于1.5mL硅化管內(nèi)，氮氣干化后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱預(yù)平衡1h，然后加入500μl制備好的精子懸液，PAF終濃度為10-7mol/L[2]；陽性對照組加入相同的500μl精子懸液，同時加入2.6μl A23187溶液，使其終末濃度為10μmol/L；空白對照組加入含等量DMSO的溶液（DMSO濃度＜1%）。三組均放入37℃含有5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培育15min后轉(zhuǎn)移至對應(yīng)離心管內(nèi)，加入H258溶液5μl，繼續(xù)培育5min。用0.9%生理鹽水150g離心10min洗滌2次。棄去上清液，取精子沉淀20μl進行FITC-PSA染色。將20μl精子沉淀制片后，室溫下避光自然干燥, 95%酒精固定30min，超純水沖洗15min，甩干。取1mL FITC-PSA貯存液加入1mLPBS液，配成終末濃度為50μg/mL，常溫下將固定好的精子涂片用FITC-PSA避光染色30min。12.5%戊二醛溶液終止AR。超純水沖洗10min，自然風(fēng)干。滴加含0.22mol/L DABCO的甘油溶液作為熒光封固劑封片。4℃下避光短暫保存，采用病理圖像分析儀熒光顯微鏡（德國LEICA，DMR+Q550），100×油鏡觀察。每張精子涂片檢查四方和中央共5個區(qū)域，計數(shù)≥200個精子，計數(shù)發(fā)生AR的活精子數(shù)并換算成百分率。記錄，存圖。

四、結(jié)果分析

1. 頂體完整，活精子：Hoechst 33258-/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光而核區(qū)無藍(lán)光。

2. 頂體完整，死精：Hoechst 33258+/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光，核區(qū)有藍(lán)光。

3. 發(fā)生頂體反應(yīng)，活精子： Hoechst33258-/ PSA+ Ⅰ型 頂體帽部分脫落，精子頭部帽狀球形黃綠色熒光呈不均勻，核區(qū)無藍(lán)光—表示剛發(fā)生AR不久，頂體內(nèi)容物尚未完全丟失；Ⅱ型 頂體帽全部脫落，精子頭部帽狀球形下保留一明顯條帶狀（赤道板狀）黃綠色熒光染色區(qū)，核區(qū)無藍(lán)光—表示完全發(fā)生AR者；或Hoechst 33258-/PSA- Ⅲ型頂體區(qū)和頂體后區(qū)均無熒光，核區(qū)無藍(lán)光—表示全頂體破裂，是早已完成AR者。

4. 頂體缺失，死精：Hoechst 33258＋/PSA- 頂體帽無熒光，核區(qū)有藍(lán)光。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包，組內(nèi)各AR%均呈近似正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩組間比較采用配對均數(shù)比較t檢驗，當(dāng)P＜0 .05說明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

PAF組人精子AR%（29.90±10.815）和A23187組人精子AR%（54.93±1.320）均明顯高于空白對照組的自發(fā)性AR%（13.54±7.820）；PAF組人精子AR%（29.90±10.815）低于A23187組人精子AR%（54.93± 1.320），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 此外，根據(jù)世界衛(wèi)生組織精液分析手冊（WHO，2001）的標(biāo)準(zhǔn)，鈣離子載體激發(fā)（ARIC）的實際AR為A23187組%AR減去空白對照組%AR，本實驗ARIC%AR為（41.39±15.15）%。根據(jù)手冊，ARIC%AR的正常值為15%，如＜10%為異常，10%～15%之間提示精子功能可能異常。本實驗結(jié)果大于15%，提示所取對象精子頂體功能正常。

討 論

本實驗通過PAF和A23187誘導(dǎo)人精子頂體反應(yīng)，研究兩者對精子頂體反應(yīng)的影響。為避免死精或退化頂體丟失造成AR的假相，因而檢測AR必須同時檢測是否為活精子。本實驗采用Hoechst33258聯(lián)合FITCPSA標(biāo)記法[4]，對精子進行雙重染色剔除死精子對AR發(fā)生率的干擾，可以同時測得精子頂體狀態(tài)及是否是活精子。FITC受激發(fā)光（450nm～490nm）的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色），Hoechst33258受紫外光（280nm～360nm）照射發(fā)出藍(lán)光。

本實驗結(jié)果表明，PAF和A23187均能誘導(dǎo)人精子發(fā)生AR，但兩者誘導(dǎo)AR的強度不同，PAF組頂體反應(yīng)率明顯低于A23187組，可能是A23187的作用超過了正常的生理反應(yīng)。由于A23187一方面可使大量精子迅速致死，另一方面由于它具毒性，因此，A23187誘發(fā)AR主要用于科研。

迄今已知透明帶、透明帶溶解液或提純的透明帶分子組分ZP與獲能精子培養(yǎng)，均可誘導(dǎo) AR。因為這類成分是天然物質(zhì)，故通常認(rèn)為這樣誘導(dǎo)的AR代表或接近于體內(nèi)發(fā)生的自然AR。有研究表明活精子的AR%與精子的卵透明帶穿透率呈強正相關(guān)，透明帶誘發(fā)精子AR%已成為評價精子功能的一個可靠的指標(biāo)[5,6]。但是一個存在的問題是無法獲得大量天然的人透明帶用于臨床不育診斷研究。因此，體外要準(zhǔn)確評價人類精子AR功能，需要有合適的生理性誘導(dǎo)因子，這樣誘導(dǎo)AR才更接近生理性。國外采用完整人卵透明帶誘導(dǎo)精子AR，其發(fā)生率平均為45%[5]；國內(nèi)有研究采用人透明帶糖蛋白誘導(dǎo)人精子， AR%為（32.45±6.92）%[7]；采用可溶性人ZP，誘導(dǎo)精子AR%約為30%[8]；而采用與人卵透明帶有交叉反應(yīng)性的小鼠，ZP誘導(dǎo)人精子AR，其發(fā)生率只有22%～30%[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)PAF誘導(dǎo)的精子AR%雖不及A23187高，但PAF誘導(dǎo)的AR%結(jié)果（29.90± 10.815）%與上述學(xué)者用天然物質(zhì)誘導(dǎo)精子AR%的結(jié)果接近[10,11]。提示PAF誘導(dǎo)人精子的AR可能更具有實用價值，其是否可為人類AR的研究和AR缺陷綜合征的臨床診斷提供有利的手段，臨床上幫助不孕夫婦選擇合適的助孕方式并預(yù)測IVF受精失敗，仍有待通過進一步研究PAF誘導(dǎo)的人精子AR與透明帶誘導(dǎo)的人精子AR的關(guān)系來證實。

目前PAF對人精子AR的確切作用機制尚不清楚。多位學(xué)者在精子尾部頸段和中段發(fā)現(xiàn)了PAF受體（PAF receptor，PAFR）濃度最高[12]。頸段是近端中心粒的位置，PAF可能對中心粒完整的精子有刺激影響，而精子尾部中段既是線粒體場所也是精子活動的關(guān)鍵部位。胞內(nèi)Ca2+濃度增加是誘導(dǎo)精子獲能和AR的必須條件。推測PAF是通過受體介導(dǎo)調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度影響精子活力和受精潛力，提高成功受精率及胚胎發(fā)育率。近年來有學(xué)者在豬精子上檢測到PAF受體，同時認(rèn)為鈣離子誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)是通過PAF刺激來調(diào)節(jié)的[13]。PAF對精子功能的影響是受體介導(dǎo)的屬于IP3、二酰甘油（diacylglycerol，DAG）、Ca2+的信使系統(tǒng)[14]：PAF通過與細(xì)胞上特異性G蛋白受體結(jié)合后激活磷酸肌醇特異性的磷脂酶C（phospholipase C，PLC），催化質(zhì)膜上磷脂酰肌醇（phosphatidyl inosito，PI）水解，產(chǎn)生兩個第二信使——IP3和DAG，IP3通過兩條途徑引起胞內(nèi)Ca2+濃度的升高：（1）細(xì)胞線粒體內(nèi)儲存Ca2+的釋放；（2）細(xì)胞外Ca2+通過通道向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。繼之激活蛋白激酶C（protein kinase，PKC），催化靶蛋白磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15]。Sengoku等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PKA、PKC、PTK的抑制劑能降低PAF誘導(dǎo)的AR%，這就提示這三者信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能參與調(diào)節(jié)PAF誘導(dǎo)AR。

本研究除了發(fā)現(xiàn)A23187誘導(dǎo)的精子AR%明顯高于PAF外，還發(fā)現(xiàn)了A23187誘導(dǎo)AR精子類型主要是Ⅱ型，屬完全AR，說明誘導(dǎo)AR時間快（見圖1）；而PAF誘導(dǎo)AR精子類型主要屬于Ⅰ型，屬部分AR（見圖2）。主要原因可能與兩者誘導(dǎo)AR機制不同有關(guān)。A23187作為親脂性Ca2+載體，通過Ca2+和H+交換，使胞外Ca2+大量流入細(xì)胞內(nèi)，促進cAMP產(chǎn)生，進而激活了cAMP-PKA系統(tǒng)，最終使一些蛋白質(zhì)磷酸化，調(diào)節(jié)了精子質(zhì)膜融合，同時鈣離子啟動細(xì)胞骨架系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)出類似胞吐的AR。

圖1 A23187 組(Ⅱ型為主)

圖2 PAF 組(Ⅰ型為主)

綜上所述，A23187和PAF均可用于檢測獲能精子發(fā)生AR的能力。在相同的獲能及誘導(dǎo)時間下，PAF誘導(dǎo)的AR與A23187誘導(dǎo)的AR有顯著性差異，從而也說明了PAF和A23187誘導(dǎo)的AR不同。PAF作為一個內(nèi)源性因子，其誘導(dǎo)人精子AR的能力可能更接近于生理透明帶誘導(dǎo)的能力，推測其能更真實反映精子AR的情況。

精子; 血小板活化因子; 頂體反應(yīng)

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（2013-11-11收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.017

Q545; R321.1

*通訊作者, E-mail: lmj1699@vip.163.com