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        血小板活化因子和A23187對(duì)精子頂體反應(yīng)的影響

        2014-04-22 09:03:10黃千貽李慕軍江吳惠梅
        中國(guó)男科學(xué)雜志 2014年6期
        關(guān)鍵詞:頂體核區(qū)藍(lán)光

        黃千貽 李慕軍江 莉 吳惠梅

        廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心(南寧 530021)

        ·研究簡(jiǎn)報(bào)·

        血小板活化因子和A23187對(duì)精子頂體反應(yīng)的影響

        黃千貽 李慕軍*江 莉 吳惠梅

        廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心(南寧 530021)

        頂體反應(yīng)(AR)是精子受精過程中的一個(gè)必要過程。在IVF或體內(nèi)自然受精過程中,精子的AR是由透明帶糖蛋白受體誘發(fā)的[1],只有透明帶誘發(fā)的AR才具有重要生理意義。但是目前無法分離出足夠的此類物質(zhì)以常規(guī)測(cè)定精子頂體功能并應(yīng)用于診斷,所以需要研究天然AR激動(dòng)劑的替代物及建立最佳誘導(dǎo)AR體系,這樣誘導(dǎo)的AR才更符合生理要求。已知大量的內(nèi)源性因子可以調(diào)節(jié)精子生育的潛能,其中包括血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)。有研究表明,PAF除有血小板激活功能外,其還能誘導(dǎo)動(dòng)物精子體外獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)[2,3]。本實(shí)驗(yàn)采取鈣離子載體(A23187)誘導(dǎo)人精子AR作為陽性對(duì)照組,以探討PAF對(duì)人精子AR的影響,為尋求天然AR激動(dòng)劑的替代物及建立最佳誘導(dǎo)AR體系提供有力的理論依據(jù),同時(shí)為不育癥的診治開辟一條新的途徑。

        材料方法

        一、試劑準(zhǔn)備

        1. PAF貯存液:0.3mL PAF溶液稀釋于114mL氯仿和甲醇的混和液中(氯仿:甲醇為1:4),配成終濃度為10-5mol/L的溶液,分裝后儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        2. FITC-PSA貯存液:2mgFITC-PSA溶于20mL PBS(pH值7.4),1mL分裝,4℃避光保存。

        3. A23187:1mgA23187溶解于1mL DMSO中,配成終末濃度為1mg/mL溶液,少量分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆?,此過程避光操作。

        4. 熒光DNA粘合染料(Hoechst33258,H258):取1mg溶于50mL PBS(pH值7.4)中,配成終末濃度為100μg/mL的溶液,分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

        二、樣本和精液制備

        32例為接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療患者,女方為繼發(fā)不孕患者,男方為健康且曾使女方懷孕患者,精液常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍(符合WHO人類精液分析標(biāo)準(zhǔn)2001年)。取卵日當(dāng)天早上囑男方以手淫法獲取精液(禁欲2~7d),裝入無菌取精杯中,液化后進(jìn)行精液常規(guī)分析。精液處理采用40%、80% percoll密度梯度離心法,三次離心后去部分表層,留至0.5mL精液,取部分上層液,加入ART-1020顯微鏡下調(diào)整密度2~5×106/mL至少2mL備用。將至少2mL已制備好的精子懸液放入37℃含有5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培育4h,使其獲能。

        三、誘導(dǎo)頂體反應(yīng)和評(píng)估頂體狀態(tài)

        PAF組取10μl PAF貯存液置于1.5mL硅化管內(nèi),氮?dú)飧苫蠓湃?7℃、5%CO2培養(yǎng)箱預(yù)平衡1h,然后加入500μl制備好的精子懸液,PAF終濃度為10-7mol/L[2];陽性對(duì)照組加入相同的500μl精子懸液,同時(shí)加入2.6μl A23187溶液,使其終末濃度為10μmol/L;空白對(duì)照組加入含等量DMSO的溶液(DMSO濃度<1%)。三組均放入37℃含有5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培育15min后轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)離心管內(nèi),加入H258溶液5μl,繼續(xù)培育5min。用0.9%生理鹽水150g離心10min洗滌2次。棄去上清液,取精子沉淀20μl進(jìn)行FITC-PSA染色。將20μl精子沉淀制片后,室溫下避光自然干燥, 95%酒精固定30min,超純水沖洗15min,甩干。取1mL FITC-PSA貯存液加入1mLPBS液,配成終末濃度為50μg/mL,常溫下將固定好的精子涂片用FITC-PSA避光染色30min。12.5%戊二醛溶液終止AR。超純水沖洗10min,自然風(fēng)干。滴加含0.22mol/L DABCO的甘油溶液作為熒光封固劑封片。4℃下避光短暫保存,采用病理圖像分析儀熒光顯微鏡(德國(guó)LEICA,DMR+Q550),100×油鏡觀察。每張精子涂片檢查四方和中央共5個(gè)區(qū)域,計(jì)數(shù)≥200個(gè)精子,計(jì)數(shù)發(fā)生AR的活精子數(shù)并換算成百分率。記錄,存圖。

        四、結(jié)果分析

        1. 頂體完整,活精子:Hoechst 33258-/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光而核區(qū)無藍(lán)光。

        2. 頂體完整,死精:Hoechst 33258+/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光,核區(qū)有藍(lán)光。

        3. 發(fā)生頂體反應(yīng),活精子: Hoechst33258-/ PSA+ Ⅰ型 頂體帽部分脫落,精子頭部帽狀球形黃綠色熒光呈不均勻,核區(qū)無藍(lán)光—表示剛發(fā)生AR不久,頂體內(nèi)容物尚未完全丟失;Ⅱ型 頂體帽全部脫落,精子頭部帽狀球形下保留一明顯條帶狀(赤道板狀)黃綠色熒光染色區(qū),核區(qū)無藍(lán)光—表示完全發(fā)生AR者;或Hoechst 33258-/PSA- Ⅲ型頂體區(qū)和頂體后區(qū)均無熒光,核區(qū)無藍(lán)光—表示全頂體破裂,是早已完成AR者。

        4. 頂體缺失,死精:Hoechst 33258+/PSA- 頂體帽無熒光,核區(qū)有藍(lán)光。

        五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包,組內(nèi)各AR%均呈近似正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩兩組間比較采用配對(duì)均數(shù)比較t檢驗(yàn),當(dāng)P<0 .05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        PAF組人精子AR%(29.90±10.815)和A23187組人精子AR%(54.93±1.320)均明顯高于空白對(duì)照組的自發(fā)性AR%(13.54±7.820);PAF組人精子AR%(29.90±10.815)低于A23187組人精子AR%(54.93± 1.320),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 此外,根據(jù)世界衛(wèi)生組織精液分析手冊(cè)(WHO,2001)的標(biāo)準(zhǔn),鈣離子載體激發(fā)(ARIC)的實(shí)際AR為A23187組%AR減去空白對(duì)照組%AR,本實(shí)驗(yàn)ARIC%AR為(41.39±15.15)%。根據(jù)手冊(cè),ARIC%AR的正常值為15%,如<10%為異常,10%~15%之間提示精子功能可能異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大于15%,提示所取對(duì)象精子頂體功能正常。

        討 論

        本實(shí)驗(yàn)通過PAF和A23187誘導(dǎo)人精子頂體反應(yīng),研究?jī)烧邔?duì)精子頂體反應(yīng)的影響。為避免死精或退化頂體丟失造成AR的假相,因而檢測(cè)AR必須同時(shí)檢測(cè)是否為活精子。本實(shí)驗(yàn)采用Hoechst33258聯(lián)合FITCPSA標(biāo)記法[4],對(duì)精子進(jìn)行雙重染色剔除死精子對(duì)AR發(fā)生率的干擾,可以同時(shí)測(cè)得精子頂體狀態(tài)及是否是活精子。FITC受激發(fā)光(450nm~490nm)的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色),Hoechst33258受紫外光(280nm~360nm)照射發(fā)出藍(lán)光。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PAF和A23187均能誘導(dǎo)人精子發(fā)生AR,但兩者誘導(dǎo)AR的強(qiáng)度不同,PAF組頂體反應(yīng)率明顯低于A23187組,可能是A23187的作用超過了正常的生理反應(yīng)。由于A23187一方面可使大量精子迅速致死,另一方面由于它具毒性,因此,A23187誘發(fā)AR主要用于科研。

        迄今已知透明帶、透明帶溶解液或提純的透明帶分子組分ZP與獲能精子培養(yǎng),均可誘導(dǎo) AR。因?yàn)檫@類成分是天然物質(zhì),故通常認(rèn)為這樣誘導(dǎo)的AR代表或接近于體內(nèi)發(fā)生的自然AR。有研究表明活精子的AR%與精子的卵透明帶穿透率呈強(qiáng)正相關(guān),透明帶誘發(fā)精子AR%已成為評(píng)價(jià)精子功能的一個(gè)可靠的指標(biāo)[5,6]。但是一個(gè)存在的問題是無法獲得大量天然的人透明帶用于臨床不育診斷研究。因此,體外要準(zhǔn)確評(píng)價(jià)人類精子AR功能,需要有合適的生理性誘導(dǎo)因子,這樣誘導(dǎo)AR才更接近生理性。國(guó)外采用完整人卵透明帶誘導(dǎo)精子AR,其發(fā)生率平均為45%[5];國(guó)內(nèi)有研究采用人透明帶糖蛋白誘導(dǎo)人精子, AR%為(32.45±6.92)%[7];采用可溶性人ZP,誘導(dǎo)精子AR%約為30%[8];而采用與人卵透明帶有交叉反應(yīng)性的小鼠,ZP誘導(dǎo)人精子AR,其發(fā)生率只有22%~30%[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)PAF誘導(dǎo)的精子AR%雖不及A23187高,但PAF誘導(dǎo)的AR%結(jié)果(29.90± 10.815)%與上述學(xué)者用天然物質(zhì)誘導(dǎo)精子AR%的結(jié)果接近[10,11]。提示PAF誘導(dǎo)人精子的AR可能更具有實(shí)用價(jià)值,其是否可為人類AR的研究和AR缺陷綜合征的臨床診斷提供有利的手段,臨床上幫助不孕夫婦選擇合適的助孕方式并預(yù)測(cè)IVF受精失敗,仍有待通過進(jìn)一步研究PAF誘導(dǎo)的人精子AR與透明帶誘導(dǎo)的人精子AR的關(guān)系來證實(shí)。

        目前PAF對(duì)人精子AR的確切作用機(jī)制尚不清楚。多位學(xué)者在精子尾部頸段和中段發(fā)現(xiàn)了PAF受體(PAF receptor,PAFR)濃度最高[12]。頸段是近端中心粒的位置,PAF可能對(duì)中心粒完整的精子有刺激影響,而精子尾部中段既是線粒體場(chǎng)所也是精子活動(dòng)的關(guān)鍵部位。胞內(nèi)Ca2+濃度增加是誘導(dǎo)精子獲能和AR的必須條件。推測(cè)PAF是通過受體介導(dǎo)調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度影響精子活力和受精潛力,提高成功受精率及胚胎發(fā)育率。近年來有學(xué)者在豬精子上檢測(cè)到PAF受體,同時(shí)認(rèn)為鈣離子誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)是通過PAF刺激來調(diào)節(jié)的[13]。PAF對(duì)精子功能的影響是受體介導(dǎo)的屬于IP3、二酰甘油(diacylglycerol,DAG)、Ca2+的信使系統(tǒng)[14]:PAF通過與細(xì)胞上特異性G蛋白受體結(jié)合后激活磷酸肌醇特異性的磷脂酶C(phospholipase C,PLC),催化質(zhì)膜上磷脂酰肌醇(phosphatidyl inosito,PI)水解,產(chǎn)生兩個(gè)第二信使——IP3和DAG,IP3通過兩條途徑引起胞內(nèi)Ca2+濃度的升高:(1)細(xì)胞線粒體內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+的釋放;(2)細(xì)胞外Ca2+通過通道向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。繼之激活蛋白激酶C(protein kinase,PKC),催化靶蛋白磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15]。Sengoku等[16]研究發(fā)現(xiàn),PKA、PKC、PTK的抑制劑能降低PAF誘導(dǎo)的AR%,這就提示這三者信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能參與調(diào)節(jié)PAF誘導(dǎo)AR。

        本研究除了發(fā)現(xiàn)A23187誘導(dǎo)的精子AR%明顯高于PAF外,還發(fā)現(xiàn)了A23187誘導(dǎo)AR精子類型主要是Ⅱ型,屬完全AR,說明誘導(dǎo)AR時(shí)間快(見圖1);而PAF誘導(dǎo)AR精子類型主要屬于Ⅰ型,屬部分AR(見圖2)。主要原因可能與兩者誘導(dǎo)AR機(jī)制不同有關(guān)。A23187作為親脂性Ca2+載體,通過Ca2+和H+交換,使胞外Ca2+大量流入細(xì)胞內(nèi),促進(jìn)cAMP產(chǎn)生,進(jìn)而激活了cAMP-PKA系統(tǒng),最終使一些蛋白質(zhì)磷酸化,調(diào)節(jié)了精子質(zhì)膜融合,同時(shí)鈣離子啟動(dòng)細(xì)胞骨架系統(tǒng),從而誘導(dǎo)出類似胞吐的AR。

        圖1 A23187 組(Ⅱ型為主)

        圖2 PAF 組(Ⅰ型為主)

        綜上所述,A23187和PAF均可用于檢測(cè)獲能精子發(fā)生AR的能力。在相同的獲能及誘導(dǎo)時(shí)間下,PAF誘導(dǎo)的AR與A23187誘導(dǎo)的AR有顯著性差異,從而也說明了PAF和A23187誘導(dǎo)的AR不同。PAF作為一個(gè)內(nèi)源性因子,其誘導(dǎo)人精子AR的能力可能更接近于生理透明帶誘導(dǎo)的能力,推測(cè)其能更真實(shí)反映精子AR的情況。

        精子; 血小板活化因子; 頂體反應(yīng)

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        (2013-11-11收稿)

        10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.017

        Q545; R321.1

        *通訊作者, E-mail: lmj1699@vip.163.com

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