黃千貽 李慕軍江 莉 吳惠梅

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心（南寧 530021）

·研究簡(jiǎn)報(bào)·

血小板活化因子和A23187對(duì)精子頂體反應(yīng)的影響

黃千貽 李慕軍*江 莉 吳惠梅

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心（南寧 530021）

頂體反應(yīng)（AR）是精子受精過程中的一個(gè)必要過程。在IVF或體內(nèi)自然受精過程中，精子的AR是由透明帶糖蛋白受體誘發(fā)的[1]，只有透明帶誘發(fā)的AR才具有重要生理意義。但是目前無法分離出足夠的此類物質(zhì)以常規(guī)測(cè)定精子頂體功能并應(yīng)用于診斷，所以需要研究天然AR激動(dòng)劑的替代物及建立最佳誘導(dǎo)AR體系，這樣誘導(dǎo)的AR才更符合生理要求。已知大量的內(nèi)源性因子可以調(diào)節(jié)精子生育的潛能，其中包括血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）。有研究表明，PAF除有血小板激活功能外，其還能誘導(dǎo)動(dòng)物精子體外獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)[2,3]。本實(shí)驗(yàn)采取鈣離子載體（A23187）誘導(dǎo)人精子AR作為陽性對(duì)照組，以探討PAF對(duì)人精子AR的影響，為尋求天然AR激動(dòng)劑的替代物及建立最佳誘導(dǎo)AR體系提供有力的理論依據(jù)，同時(shí)為不育癥的診治開辟一條新的途徑。

材料方法

一、試劑準(zhǔn)備

1. PAF貯存液：0.3mL PAF溶液稀釋于114mL氯仿和甲醇的混和液中（氯仿:甲醇為1:4），配成終濃度為10-5mol/L的溶液，分裝后儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2. FITC-PSA貯存液：2mgFITC-PSA溶于20mL PBS（pH值7.4），1mL分裝，4℃避光保存。

3. A23187：1mgA23187溶解于1mL DMSO中，配成終末濃度為1mg/mL溶液，少量分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆?，此過程避光操作。

4. 熒光DNA粘合染料（Hoechst33258，H258）：取1mg溶于50mL PBS（pH值7.4）中，配成終末濃度為100μg/mL的溶液，分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

二、樣本和精液制備

32例為接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療患者，女方為繼發(fā)不孕患者，男方為健康且曾使女方懷孕患者，精液常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍（符合WHO人類精液分析標(biāo)準(zhǔn)2001年）。取卵日當(dāng)天早上囑男方以手淫法獲取精液（禁欲2～7d），裝入無菌取精杯中，液化后進(jìn)行精液常規(guī)分析。精液處理采用40%、80% percoll密度梯度離心法，三次離心后去部分表層，留至0.5mL精液，取部分上層液，加入ART-1020顯微鏡下調(diào)整密度2～5×106/mL至少2mL備用。將至少2mL已制備好的精子懸液放入37℃含有5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培育4h，使其獲能。

三、誘導(dǎo)頂體反應(yīng)和評(píng)估頂體狀態(tài)

PAF組取10μl PAF貯存液置于1.5mL硅化管內(nèi)，氮?dú)飧苫蠓湃?7℃、5%CO2培養(yǎng)箱預(yù)平衡1h，然后加入500μl制備好的精子懸液，PAF終濃度為10-7mol/L[2]；陽性對(duì)照組加入相同的500μl精子懸液，同時(shí)加入2.6μl A23187溶液，使其終末濃度為10μmol/L；空白對(duì)照組加入含等量DMSO的溶液（DMSO濃度＜1%）。三組均放入37℃含有5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培育15min后轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)離心管內(nèi)，加入H258溶液5μl，繼續(xù)培育5min。用0.9%生理鹽水150g離心10min洗滌2次。棄去上清液，取精子沉淀20μl進(jìn)行FITC-PSA染色。將20μl精子沉淀制片后，室溫下避光自然干燥, 95%酒精固定30min，超純水沖洗15min，甩干。取1mL FITC-PSA貯存液加入1mLPBS液，配成終末濃度為50μg/mL，常溫下將固定好的精子涂片用FITC-PSA避光染色30min。12.5%戊二醛溶液終止AR。超純水沖洗10min，自然風(fēng)干。滴加含0.22mol/L DABCO的甘油溶液作為熒光封固劑封片。4℃下避光短暫保存，采用病理圖像分析儀熒光顯微鏡（德國(guó)LEICA，DMR+Q550），100×油鏡觀察。每張精子涂片檢查四方和中央共5個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)≥200個(gè)精子，計(jì)數(shù)發(fā)生AR的活精子數(shù)并換算成百分率。記錄，存圖。

四、結(jié)果分析

1. 頂體完整，活精子：Hoechst 33258-/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光而核區(qū)無藍(lán)光。

2. 頂體完整，死精：Hoechst 33258+/PSA+ 頂體帽有黃綠色熒光，核區(qū)有藍(lán)光。

3. 發(fā)生頂體反應(yīng)，活精子： Hoechst33258-/ PSA+ Ⅰ型 頂體帽部分脫落，精子頭部帽狀球形黃綠色熒光呈不均勻，核區(qū)無藍(lán)光—表示剛發(fā)生AR不久，頂體內(nèi)容物尚未完全丟失；Ⅱ型 頂體帽全部脫落，精子頭部帽狀球形下保留一明顯條帶狀（赤道板狀）黃綠色熒光染色區(qū)，核區(qū)無藍(lán)光—表示完全發(fā)生AR者；或Hoechst 33258-/PSA- Ⅲ型頂體區(qū)和頂體后區(qū)均無熒光，核區(qū)無藍(lán)光—表示全頂體破裂，是早已完成AR者。

4. 頂體缺失，死精：Hoechst 33258＋/PSA- 頂體帽無熒光，核區(qū)有藍(lán)光。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，組內(nèi)各AR%均呈近似正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩組間比較采用配對(duì)均數(shù)比較t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0 .05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

PAF組人精子AR%（29.90±10.815）和A23187組人精子AR%（54.93±1.320）均明顯高于空白對(duì)照組的自發(fā)性AR%（13.54±7.820）；PAF組人精子AR%（29.90±10.815）低于A23187組人精子AR%（54.93± 1.320），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 此外，根據(jù)世界衛(wèi)生組織精液分析手冊(cè)（WHO，2001）的標(biāo)準(zhǔn)，鈣離子載體激發(fā)（ARIC）的實(shí)際AR為A23187組%AR減去空白對(duì)照組%AR，本實(shí)驗(yàn)ARIC%AR為（41.39±15.15）%。根據(jù)手冊(cè)，ARIC%AR的正常值為15%，如＜10%為異常，10%～15%之間提示精子功能可能異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大于15%，提示所取對(duì)象精子頂體功能正常。

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過PAF和A23187誘導(dǎo)人精子頂體反應(yīng)，研究?jī)烧邔?duì)精子頂體反應(yīng)的影響。為避免死精或退化頂體丟失造成AR的假相，因而檢測(cè)AR必須同時(shí)檢測(cè)是否為活精子。本實(shí)驗(yàn)采用Hoechst33258聯(lián)合FITCPSA標(biāo)記法[4]，對(duì)精子進(jìn)行雙重染色剔除死精子對(duì)AR發(fā)生率的干擾，可以同時(shí)測(cè)得精子頂體狀態(tài)及是否是活精子。FITC受激發(fā)光（450nm～490nm）的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色），Hoechst33258受紫外光（280nm～360nm）照射發(fā)出藍(lán)光。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAF和A23187均能誘導(dǎo)人精子發(fā)生AR，但兩者誘導(dǎo)AR的強(qiáng)度不同，PAF組頂體反應(yīng)率明顯低于A23187組，可能是A23187的作用超過了正常的生理反應(yīng)。由于A23187一方面可使大量精子迅速致死，另一方面由于它具毒性，因此，A23187誘發(fā)AR主要用于科研。

迄今已知透明帶、透明帶溶解液或提純的透明帶分子組分ZP與獲能精子培養(yǎng)，均可誘導(dǎo) AR。因?yàn)檫@類成分是天然物質(zhì)，故通常認(rèn)為這樣誘導(dǎo)的AR代表或接近于體內(nèi)發(fā)生的自然AR。有研究表明活精子的AR%與精子的卵透明帶穿透率呈強(qiáng)正相關(guān)，透明帶誘發(fā)精子AR%已成為評(píng)價(jià)精子功能的一個(gè)可靠的指標(biāo)[5,6]。但是一個(gè)存在的問題是無法獲得大量天然的人透明帶用于臨床不育診斷研究。因此，體外要準(zhǔn)確評(píng)價(jià)人類精子AR功能，需要有合適的生理性誘導(dǎo)因子，這樣誘導(dǎo)AR才更接近生理性。國(guó)外采用完整人卵透明帶誘導(dǎo)精子AR，其發(fā)生率平均為45%[5]；國(guó)內(nèi)有研究采用人透明帶糖蛋白誘導(dǎo)人精子， AR%為（32.45±6.92）%[7]；采用可溶性人ZP，誘導(dǎo)精子AR%約為30%[8]；而采用與人卵透明帶有交叉反應(yīng)性的小鼠，ZP誘導(dǎo)人精子AR，其發(fā)生率只有22%～30%[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)PAF誘導(dǎo)的精子AR%雖不及A23187高，但PAF誘導(dǎo)的AR%結(jié)果（29.90± 10.815）%與上述學(xué)者用天然物質(zhì)誘導(dǎo)精子AR%的結(jié)果接近[10,11]。提示PAF誘導(dǎo)人精子的AR可能更具有實(shí)用價(jià)值，其是否可為人類AR的研究和AR缺陷綜合征的臨床診斷提供有利的手段，臨床上幫助不孕夫婦選擇合適的助孕方式并預(yù)測(cè)IVF受精失敗，仍有待通過進(jìn)一步研究PAF誘導(dǎo)的人精子AR與透明帶誘導(dǎo)的人精子AR的關(guān)系來證實(shí)。

目前PAF對(duì)人精子AR的確切作用機(jī)制尚不清楚。多位學(xué)者在精子尾部頸段和中段發(fā)現(xiàn)了PAF受體（PAF receptor，PAFR）濃度最高[12]。頸段是近端中心粒的位置，PAF可能對(duì)中心粒完整的精子有刺激影響，而精子尾部中段既是線粒體場(chǎng)所也是精子活動(dòng)的關(guān)鍵部位。胞內(nèi)Ca2+濃度增加是誘導(dǎo)精子獲能和AR的必須條件。推測(cè)PAF是通過受體介導(dǎo)調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度影響精子活力和受精潛力，提高成功受精率及胚胎發(fā)育率。近年來有學(xué)者在豬精子上檢測(cè)到PAF受體，同時(shí)認(rèn)為鈣離子誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)是通過PAF刺激來調(diào)節(jié)的[13]。PAF對(duì)精子功能的影響是受體介導(dǎo)的屬于IP3、二酰甘油（diacylglycerol，DAG）、Ca2+的信使系統(tǒng)[14]：PAF通過與細(xì)胞上特異性G蛋白受體結(jié)合后激活磷酸肌醇特異性的磷脂酶C（phospholipase C，PLC），催化質(zhì)膜上磷脂酰肌醇（phosphatidyl inosito，PI）水解，產(chǎn)生兩個(gè)第二信使——IP3和DAG，IP3通過兩條途徑引起胞內(nèi)Ca2+濃度的升高：（1）細(xì)胞線粒體內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+的釋放；（2）細(xì)胞外Ca2+通過通道向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。繼之激活蛋白激酶C（protein kinase，PKC），催化靶蛋白磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15]。Sengoku等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PKA、PKC、PTK的抑制劑能降低PAF誘導(dǎo)的AR%，這就提示這三者信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能參與調(diào)節(jié)PAF誘導(dǎo)AR。

本研究除了發(fā)現(xiàn)A23187誘導(dǎo)的精子AR%明顯高于PAF外，還發(fā)現(xiàn)了A23187誘導(dǎo)AR精子類型主要是Ⅱ型，屬完全AR，說明誘導(dǎo)AR時(shí)間快（見圖1）；而PAF誘導(dǎo)AR精子類型主要屬于Ⅰ型，屬部分AR（見圖2）。主要原因可能與兩者誘導(dǎo)AR機(jī)制不同有關(guān)。A23187作為親脂性Ca2+載體，通過Ca2+和H+交換，使胞外Ca2+大量流入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)cAMP產(chǎn)生，進(jìn)而激活了cAMP-PKA系統(tǒng)，最終使一些蛋白質(zhì)磷酸化，調(diào)節(jié)了精子質(zhì)膜融合，同時(shí)鈣離子啟動(dòng)細(xì)胞骨架系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)出類似胞吐的AR。

圖1 A23187 組(Ⅱ型為主)

圖2 PAF 組(Ⅰ型為主)

綜上所述，A23187和PAF均可用于檢測(cè)獲能精子發(fā)生AR的能力。在相同的獲能及誘導(dǎo)時(shí)間下，PAF誘導(dǎo)的AR與A23187誘導(dǎo)的AR有顯著性差異，從而也說明了PAF和A23187誘導(dǎo)的AR不同。PAF作為一個(gè)內(nèi)源性因子，其誘導(dǎo)人精子AR的能力可能更接近于生理透明帶誘導(dǎo)的能力，推測(cè)其能更真實(shí)反映精子AR的情況。

精子; 血小板活化因子; 頂體反應(yīng)

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（2013-11-11收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.017

Q545; R321.1

*通訊作者, E-mail: lmj1699@vip.163.com