鄢澤然 張青 王瀟慧 王越 聶莉媛 劉金民

難治性癲癇對(duì)多種抗癲癇藥物交叉耐藥，其可能的機(jī)制是血腦屏障上表達(dá)增加的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體逆濃度梯度將抗癲癇藥物分子泵出血腦屏障，降低病灶處的藥物濃度，使藥物療效降低甚至失效，引起癲癇反復(fù)發(fā)作。長(zhǎng)期使用抗癲癇藥物和癲癇反復(fù)發(fā)作均可增加多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。抑制血腦屏障上多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)可能提高難治性癲癇的療效。

乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)屬于三磷酸腺苷依賴(lài)性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，廣泛分布在腦微血管、小腸、肝臟、胎盤(pán)等組織和器官中［1］，與藥物的吸收、分布和代謝有密切關(guān)系。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)的BCRP可降低透過(guò)血腦屏障的抗癲癇藥物濃度。故在血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，抑制BCRP 的表達(dá)可以增加抗癲癇藥物在腦組織中的濃度，對(duì)難治性癲癇的治療有重要意義。

柴貝止癇湯是劉金民教授在《醫(yī)學(xué)心悟》“定癇丸”的基礎(chǔ)上，繼承、吸收王永炎院士臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而成，全方由柴胡、浙貝母、法半夏、天麻、石菖蒲、牡蠣、地龍七味藥物組成，主要功效是疏肝解郁，理氣化痰，開(kāi)竅定癇。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，在抗癲癇藥物治療的基礎(chǔ)上添加中藥柴貝止癇湯可以抑制難治性癲癇患者的癇性發(fā)作，減少發(fā)作頻次，減輕發(fā)作程度，其療效優(yōu)于單用抗癲癇藥，因此推測(cè)其機(jī)制可能與二者協(xié)同增效有關(guān)。為探索柴貝止癇湯增敏抗癲癇藥物的機(jī)制，本研究擬采用地塞米松孵育大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立BCRP 高表達(dá)模型，觀(guān)察中藥柴貝止癇湯對(duì)BCRP 及BCRP 可能的調(diào)節(jié)因子核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

每批原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞需要SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠5 只，體重60～80 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-(軍)2012-0004;出籠單號(hào):0000770、0001240。

1.2 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco，12100-038)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，II 型膠原酶(Sigma，C6885)，0.25%胰酶(含乙二胺四乙酸)(Sigma，T4049)，L-谷氨酰胺(Sigma，G6392)，噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(Sigma，M5655)，A 型明膠(Sigma，G2625)，地塞米松(Sigma，D4902)，肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司，H8060-1)，胰島素(Sigma，I5500)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)支持 物(Sigma，E2759);TRIzol 試劑(Invitrogen，15596-026);逆轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒(Fermentas，K1622);Real-time PCR 預(yù)混熒光染料(TOYOBO，QPK-212)。

1.3 抗體及引物

兔抗VIII 因子抗體(Santa Cruz，sc-33584)、兔抗BCRP 抗體(Santa Cruz，sc-25822)、兔抗NF-κB p65 抗體(Santa Cruz，sc-372)、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Santa Cruz，sc-25778)、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記anti-Rabbit 抗體(Santa Cruz，sc-2004)。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記anti-Rabbit 抗體(Sigma，F(xiàn)0382)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 受試藥物

將地塞米松10 mg 溶于10 ml 無(wú)水乙醇，配制成1 mg/ml 濃儲(chǔ)液，使用時(shí)按比例稀釋成所需濃度。

柴貝止癇湯中藥配方顆粒(柴胡12 g、天麻15 g、浙貝母9 g、法半夏9 g、石菖蒲9 g、牡蠣30 g、地龍6 g)購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。稱(chēng)取10 g配方顆粒溶于100 ml D-Hank's 液中，煮沸后經(jīng)定量濾紙過(guò)濾，烘干濾紙稱(chēng)重，扣除被濾過(guò)的藥物質(zhì)量，調(diào)節(jié)中藥水溶液濃度為10 mg/ml，0.22 μm 濾器過(guò)濾后備用。

1.5 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

［2］所載方法，60～80 g Wistar 大鼠5 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天后斷頭處死。75%的酒精浸泡頭顱三次，超凈臺(tái)內(nèi)取腦，D-Hanks 液清洗，在沖洗液(8%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素、0.2 U/ml 胰島素、40 U/ml 肝素鈉及DMEM高糖培養(yǎng)基組成)中去除肉眼可見(jiàn)的血管和軟腦膜。分離大腦皮層灰質(zhì)，在沖洗液中剪成1 mm3小塊，研磨器研磨25 次(上下為1 次)，研磨液用80 目(約178 μm)尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾后再經(jīng)200 目(約74 μm)網(wǎng)篩過(guò)濾。沖洗液沖洗200 目網(wǎng)篩上微血管段，洗液經(jīng)1000 rpm 離心5 分鐘后棄上清，加入0.2%II 型膠原酶4 ml，37℃消化25 分鐘，1000 rpm離心5 分鐘，棄上清;沖洗液清洗2 次后加入4 ml完全培養(yǎng)基(20% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml鏈霉素、0.2 U/ml 胰島素、40 U/ml 肝素鈉、75 μg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)支持物、2 μmol/ml L-谷氨酰胺及DMEM 高糖培養(yǎng)基組成)，滴管輕輕吹打均勻，接種于經(jīng)2%明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中。靜置3 天后第一次換液，以后每2 天換液1 次，7～10 天后細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底的80%～90%，經(jīng)0.125%胰酶-EDTA 消化30 秒后傳代。傳至第3 代時(shí)接種至12 孔板(預(yù)包被明膠)內(nèi)爬片，接種密度為2 ×104/ml。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%玻片后，80%冷丙酮固定10 分鐘，0.3% Triton-X100 透膜20 分鐘，2%山羊血清(Gibco，16210-064)室溫封閉30 分鐘，勿洗，滴加anti-VIII 因子一抗(1∶50 稀釋)濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，滴加FITC-anti-Rabbit 二抗(1∶30 稀釋)37℃避光孵育30分鐘，清洗后滴加10 μg/ml Hoechst33258(Sigma，B1155)避光室溫孵育15 分鐘，90%甘油封片，熒光顯微鏡(紫外光、藍(lán)光)觀(guān)察染色情況。經(jīng)鑒定后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，傳代不超過(guò)第5 代。

1.6 地塞米松對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度為4 ×104/ml接種至明膠包被的96 孔板，分設(shè)空白調(diào)零孔(無(wú)細(xì)胞)、地塞米松6 個(gè)濃度組(0 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L)，每組3 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞爬滿(mǎn)孔底80%時(shí)換用含相應(yīng)濃度地塞米松的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4 小時(shí)加入MTT，培養(yǎng)結(jié)束后去除上清，加入二甲基亞砜，振蕩10 分鐘后酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm 處的吸光值(OD)。比較各濃度組的OD490，選擇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力影響較小的濃度進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞存活率=［(OD濃度組－OD調(diào)零孔)/(OD0nmol/L－OD調(diào)零孔)］×100%

1.7 BCRP 高表達(dá)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的建立

按參考文獻(xiàn)［3］所載方法和1.6 的結(jié)果，采用不同濃度的地塞米松作用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞24 小時(shí)，觀(guān)察各濃度作用下BCRP、NF-κB p65 的表達(dá)情況。選擇誘導(dǎo)BCRP 高表達(dá)的濃度進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.8 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞BCRP 和NF-κB p65 的表達(dá)

調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105/ml 后接種至明膠包被的6 孔板，分設(shè)正常組、模型組及中藥10 μg/ml、100 μg/ml、500 μg/ml、1 mg/ml 四個(gè)劑量組，每組3個(gè)復(fù)孔，經(jīng)造模和藥物干預(yù)后收集并裂解細(xì)胞，Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)樣本蛋白濃度為5 μg/μl，每孔上樣12 μl 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃過(guò)夜(anti-BCRP 1∶50 稀釋?zhuān)琣nti-NF-κB p65 1∶50 稀釋?zhuān)琣nti-GAPDH 1∶1000 稀釋)，標(biāo)記二抗(1∶5000 稀釋)，ECL 發(fā)光液顯影。條帶灰度值分析采用Image J軟件。

1.9 Real time-PCR 檢測(cè)細(xì)胞Bcrp mRNA 的表達(dá)

分組同前，總RNA 提取采用TRIzol 試劑，cDNA的合成采用Fermentas 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。PCR 反應(yīng)體系(20 μl)配置:cDNA 模板1 μl，上、下游引物各1 μl，預(yù)混熒光染料10 μl，蒸餾水7 μl。BCRP 引物設(shè)計(jì):Forward 5'-AGT CCG GAA AAC AGC TGA GA-3'，Reverse 5'-CCC ATC ACA ACG TCA TCT TG-3';GAPDH 引物設(shè)計(jì):Forward 5'-GTG CCA GCC TCG TCT CAT AG-3'，Reverse 5'-CTT TGT CAC AAG AGA AGG CAG-3'。

1.10 觀(guān)察柴貝止癇湯對(duì)細(xì)胞BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的影響

比較中藥各濃度組與模型組間BCRP、NF-κB p65 western blot 實(shí)驗(yàn)電泳條帶灰度值的差異，說(shuō)明柴貝止癇湯對(duì)BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的影響;比較中藥各濃度組與模型組間Bcrp mRNA 擴(kuò)增的值，說(shuō)明柴貝止癇湯對(duì)Bcrp mRNA 擴(kuò)增的影響。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)。平均值以(±s)表示，方差齊同各組間均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA 分析，兩兩比較采用One-Way ANOVA-LSD分析;方差不齊時(shí)各組間均數(shù)比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，兩兩比較采用One-Way ANOVA-Games-Howell 分析。設(shè)置雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

傳至第3 代時(shí)進(jìn)行VIII 因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定，見(jiàn)圖1。視野中90%以上的細(xì)胞質(zhì)被染上黃綠色熒光，細(xì)胞核染上藍(lán)色熒光(Hoechst 33258襯染)，符合血管內(nèi)皮細(xì)胞VIII 因子分布特點(diǎn)。陰性對(duì)照細(xì)胞胞質(zhì)未見(jiàn)黃綠色光。

圖1 第3 代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞VIII 因子抗原免疫熒光鑒定

2.2 地塞米松對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

地塞米松6 個(gè)濃度(0 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L)作用細(xì)胞24 小時(shí)后的細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，組間比較具有顯著性差異(χ2=33.115，P=0.000);經(jīng)One-Way ANOVAGames-Howell 分析，10 nmol/L 以上濃度孵育大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞24 小時(shí)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)活力較0 nmol/L 組下降(P＜0.05)，其中10 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L 三個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力影響較小，存活率在70%以上。

表1 地塞米松對(duì)細(xì)胞活力的影響(MTT 法)

2.3 地塞米松對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的影響

選取地塞米松對(duì)細(xì)胞活力影響較小的三個(gè)濃度(10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L)孵育細(xì)胞24小時(shí)，比較地塞米松各濃度組BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的情況(見(jiàn)圖2)。經(jīng)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，各濃度組間BCRP 表達(dá)有差異(χ2=8.641，P=0.034)，經(jīng)One-Way ANOVA-Games-Howell 分析，50 nmol/L、100 nmol/L 濃度作用24 小時(shí)后BCRP 的表達(dá)較0 nmol/L組升高(P 值分別為0.043 和0.000)。經(jīng)One-Way ANOVA-LSD 分析，NF-κB p65 的表達(dá)較0 nmol/L組降低(P 值分別為0.036 和0.039)。50 nmol/L與100 nmol/L 組間BCRP、NF-κB p65 的表達(dá)未見(jiàn)顯著差異(見(jiàn)表2)。為方便配制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用100 nmol/L 地塞米松作為干預(yù)濃度。

圖2 不同濃度地塞米松孵育細(xì)胞24 小時(shí)后BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的Western blot 電泳條帶

表2 不同濃度地塞米松影響細(xì)胞BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的情況

2.4 柴貝止癇湯對(duì)模型細(xì)胞BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的影響

大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L 地塞米松孵育24 小時(shí)后，分別用柴貝止癇湯四個(gè)濃度梯度(10 μg/ml、100 μg/ml、500 μg/ml、1 mg/ml)干預(yù)24小時(shí)。組間方差齊同，經(jīng)One-Way ANOVA-LSD 分析顯示，10 μg/ml、100 μg/ml 組細(xì)胞BCRP 的表達(dá)較模型組降低(對(duì)應(yīng)P 值分別為0.014 和0.043)，1 mg/ml濃度組細(xì)胞NF-κB p65 的表達(dá)較模型組降低(P=0.021)。(見(jiàn)圖3和表3)

圖3 不同濃度柴貝止癇湯干預(yù)模型細(xì)胞24 小時(shí)后BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的Western blot 電泳條帶

表3 不同濃度柴貝止癇湯影響模型細(xì)胞BCRP、NF-κB p65 表達(dá)的情況

2.5 柴貝止癇湯對(duì)模型細(xì)胞Bcrp mRNA 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

各組間方差齊同，經(jīng)One-Way ANOVA-LSD 分析，模型組細(xì)胞Bcrp mRNA 的表達(dá)較正常組升高(P=0.000)，正常組的表達(dá)僅為模型組的0.23 倍。柴貝止癇湯10 μg/ml、100 μg/ml 兩個(gè)濃度組Bcrp mRNA 的表達(dá)均較模型組降低(P 值均為0.000)，分別為模型組的0.36 倍和0.29 倍。(見(jiàn)表4)

3 討論

BCRP 與癲癇、腫瘤、潰瘍性結(jié)腸炎等多種疾病的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［4-6］，是繼P 糖蛋白之后發(fā)現(xiàn)的又一經(jīng)典多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體。血腦屏障上的BCRP 參與了動(dòng)物顱內(nèi)苯巴比妥、唑尼沙胺、加巴噴汀、噻加賓和左乙拉西坦的轉(zhuǎn)運(yùn)［7］，抑制BCRP 的表達(dá)可能增加動(dòng)物顱內(nèi)抗癲癇藥物濃度而提高難治性癲癇的療效。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)，柴貝止癇湯可以降低大鼠腦內(nèi)P 糖蛋白的表達(dá)，離體實(shí)驗(yàn)亦觀(guān)察到柴貝止癇湯可下調(diào)經(jīng)谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞P糖蛋白表達(dá)?；谥兴幎喟悬c(diǎn)的療效機(jī)制，本研究探索了柴貝止癇湯對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞BCRP表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)柴貝止癇湯可抑制地塞米松誘導(dǎo)的BCRP 及Bcrp mRNA 表達(dá)。

單一培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠較好地保持在體特征，細(xì)胞間可以形成豐富的緊密連接、具有極少的胞飲囊泡和窗孔結(jié)構(gòu)、擁有大量線(xiàn)粒體和豐富的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［8］，可以作為血腦屏障的單細(xì)胞體外模型。地塞米松作為孕烷X 受體的一種配體［9］，可直接激活孕烷X 受體信號(hào)通路上調(diào)BCRP的表達(dá)［3］。因此，本研究在培養(yǎng)正常大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用地塞米松孵育，模擬難治性癲癇血腦屏障上BCRP 的高表達(dá)，進(jìn)而觀(guān)察柴貝止癇湯對(duì)BCRP 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

在某些腫瘤細(xì)胞中，促炎性細(xì)胞因子可以通過(guò)激活孕烷X 受體而上調(diào)BCRP 的表達(dá)，增加BCRP的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，處于炎癥因子信號(hào)通路下游的NF-κB表達(dá)和活性也相應(yīng)增加，提示孕烷X 受體、BCRP、NFκB 三者間可能存在相關(guān)性［10-11］，而NF-κB 等炎癥因子的活化已被證實(shí)在難治性癲癇的病理過(guò)程中具有重要作用［12］。因此，本研究在觀(guān)察中藥柴貝止癇湯影響B(tài)CRP 表達(dá)的同時(shí)也探索了對(duì)炎癥因子NF-κB p65 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)中藥柴貝止癇湯高劑量(1 mg/ml)干預(yù)后的細(xì)胞NF-κB p65 表達(dá)較模型組下調(diào)。

表4 Bcrp mRNA 的表達(dá)情況(相對(duì)定量法)

相關(guān)研究認(rèn)為BCRP 和NF-κB 的活化可能是疾病預(yù)后不良的標(biāo)志［13-14］。柴貝止癇湯可以通過(guò)下調(diào)BCRP 和NF-κB 的表達(dá)來(lái)改善難治性癲癇的預(yù)后。藥物入胃，由胃運(yùn)化為精微物質(zhì)后隨氣、血、津、液的運(yùn)行布散到全身。若先天腎氣和/或后天脾氣不足，氣、血、津、液運(yùn)行不暢，出現(xiàn)氣郁、血瘀、痰凝，可阻礙藥物運(yùn)化及在腦內(nèi)的正常敷布。癲癇久治不愈、反復(fù)發(fā)作，往往引起氣、瘀、痰的相互搏結(jié)而不易根除，更加阻礙藥物轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。柴貝止癇湯中柴胡疏肝理氣，浙貝母、半夏合用可化難治之痰，地龍活血化瘀，石菖蒲引藥入腦，天麻、牡蠣平肝熄風(fēng)定癇，全方與抗癲癇藥物合用，可通過(guò)改善氣滯、血瘀和痰凝來(lái)增進(jìn)藥物在腦內(nèi)的分布，進(jìn)而改善難治性癲癇的預(yù)后。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］Mao QC，Unadkat JD.Role of the breast cancer resistance protein (ABCG2)in drug transport［J］.The AAPS Journal，2005，7(1):E118-133.

［2］李衛(wèi)紅，青雪梅，華茜，等.大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)皮層神經(jīng)元活性的影響以及通絡(luò)救腦注射液的干預(yù)作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(6):334-337.

［3］Narang VS，F(xiàn)raga C，Kumar N，et al.Dexamethasone increases expression and activity of multidrug resistance transporters at the rat blood-brain barrier［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2008，295(2):C440-C450.

［4］Sukowati CHC，Rosso N，Pascut D，et al.Gene and functional up-regulation of the BCRP/ABCG2 transporter in hepatocellular carcinoma［J］.BMC Gastroenterology，2012，12:160.

［5］Liu JYW，Thom M，Catarino CB，et al.Neuropathology of the blood-brain barrier and pharmaco-resistance in human epilepsy［J］.Brain，2012，135(10):3115-3133.

［6］Englund G，Jacobson A，Rorsman F，et al.Efflux transporters in ulcerative colitis:decreased expression of BCRP(ABCG2)and Pgp(ABCB1)［J］.Inflamm Bowel Dis，2007，13 (3):291-297.

［7］Nakanishi H，Yonezawa A，Matsubara K，et al.Impact of P-glycoprotein and breast cancer resistance protein on the brain distribution of antiepileptic drugs in knockout mouse models［J］.European Journal of Pharmacology，2013，710(1-3):20-28.

［8］趙康峰，王翀，孔建，等.不同血腦屏障模型的建立及其功能特點(diǎn)［J］.環(huán)境與健康雜志，2012，29(2):127-130.

［9］Bauer B，Hartz AMS，F(xiàn)ricker G，et al.Pregnane X receptor upregulation of P-glycoptrotein expression and transport function at the blood-brain barrier［J］.Mol Pharmacol，2004，66(3):413-419.

［10］Malekshah OM，Lage H，Bahrami AR，et al.PXR and NF-κB correlate with the inducing effects of IL-1β and TNF-α on ABCG2 expression in breast cancer cell lines［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2012，47(2):474-480.

［11］Mosaffa F，Kalalinia F，Lage H，et al.Pro-inflammatory cytokines interleukin-1β，interleukin6 and tumor necrosis factor-α alter the expression of ABCG2 in cervix and gastric cancer cells［J］.Mol Cell Biochem，2012，363(1-2):385-393.

［12］Das A，Wallace IV GC，Holmes C，et al.Hippocampal tissue of patients with refractory temporal lobe epilepsy is associated with astrocyte activation，inflammation，and altered expression of channels and receptors［J］.Neuroscience，2012，220:237-246.

［13］Lzzo JG，Wu X，Wu TT，et al.Therapy-induced expression of NF-kappa B portends poor prognosis in patients with localized esophageal cancer undergoing preoperative chemo-radiation［J］.Dis Esophagus，2009，22(2):127-132.

［14］Lee SH，Kim H，Hwang JH，et al.Breast cancer resistance protein expression is associated with early recurrence and decreased survival in resectable pancreatic cancer patients［J］.Pathology International，2012，62(3):167-175.