陳建武 王曉娟

·論著·

黃連堿對軟骨細胞增殖及轉化生長因子β1mRNA基因的表達的影響

陳建武 王曉娟

目的觀察黃連堿對Sprague Dawley大鼠關節(jié)軟骨細胞體外增殖及轉化生長因子β1mRNA基因表達的影響，探討其治療骨關節(jié)炎的作用及可能機制。方法取SD大鼠關節(jié)軟骨，剪碎后，采用酶消化法原代分離培養(yǎng)軟骨細胞，取處于對數生長期第3代細胞隨機分組，實驗組加入含10 μm黃連堿的培養(yǎng)基，對照組僅加入普通培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后在倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞形態(tài)，MTT法檢測黃連堿在1，3，5，7天對軟骨細胞增殖影響，實時熒光定量PCR分別檢測培養(yǎng)7天后實驗組和對照組細胞轉化生長因子β1mRNA表達。結果培養(yǎng)48小時后實驗組軟骨細胞生長密集程度明顯優(yōu)于對照組；MTT檢測也顯示實驗組細胞增殖情況優(yōu)于對照組；培養(yǎng)7天后實驗組轉化生長因子β1mRNA表達顯著高于對照組。結論黃連堿能促大鼠軟骨細胞增殖，并提高轉化生長因子β1mRNA的表達，提示這可能是其治療骨關節(jié)炎的可能機制之一。

黃連堿； 軟骨細胞； 增殖； 轉化生長因子β1

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是臨床最常見的關節(jié)疾病之一，其最主要的病理性改變是進行性關節(jié)軟骨退變，從而導致周圍骨質和關節(jié)滑膜發(fā)生病理改變，骨性關節(jié)炎發(fā)展到終末期會導致關節(jié)畸形而喪失功能[1]。關節(jié)軟骨細胞的過度凋亡是骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要原因。軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的細胞成分，各種細胞因子調節(jié)著軟骨細胞的增殖、分化及代謝，并始終貫穿于關節(jié)軟骨修復的過程中，目前國外研究已經證實轉化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1， TGF-β1)在軟骨細胞修復中起著重要的作用[2]。中藥黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch的干燥根莖，中醫(yī)認為長期應用具有清熱、燥濕、解毒、瀉火的功效?，F代醫(yī)學研究表明，黃連具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病等作用，黃連堿是黃連主要活性成分之一[3]。目前關于黃連堿對軟骨細胞增殖影響的研究報道較少。本研究采用體外軟骨細胞共培養(yǎng)的方法，觀察黃連堿對大鼠關節(jié)軟骨細胞的增殖及轉化生長因子β1的表達情況，初步探討其治療骨關節(jié)炎的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

本研究采用的清潔級Sprague Dawley(SD)大鼠購置于蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司，廣州，中國)；0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶、青鏈霉素混合液(Gibco，美國)；胎牛血清(FBS)(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；黃連堿(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST10030711)；PBS(索萊寶生物科技有限公司)；TGF-β1及GAPDH引物均購自上海生物工程有限公司；TRIzol(Invitogen公司，加利福尼亞，美國)；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO Life Science，東京，日本)；SYBR Green Realtime PCR master Mix-Plus(TOYOBO Life Science，東京，日本)。

1.2 儀器與設備

恒溫恒濕二氧化碳培養(yǎng)箱(型號 DH-801 上海三騰儀器有限公司，上海，中國)；酶聯免疫檢測儀(型號 RJ17DG5033A 中西集團，遼寧沈陽，中國)；紫外分光光度計(Beckman DU530 Germany)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems Company, Carlsbad, USA)；潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司，東京，日本)。

1.3 大鼠膝關節(jié)軟骨細胞的分離和培養(yǎng)

脫頸處死SD大鼠后，碘酊、75%乙醇消毒、鋪巾，正中切口切開膝關節(jié)，用無菌刀片切取股骨髁、滑車及髕骨表面的關節(jié)軟骨并置于含雙抗的PBS緩沖液無菌培養(yǎng)皿中，加蓋移入超凈工作臺，首先用含有雙抗的PBS緩沖液反復漂洗組織3次，采用無菌手術器械去除黏附于軟骨周圍的血液及組織。將沖洗清理干凈的軟骨用眼科剪剪碎并置入無菌瓶中，依次加入0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型酶，在磁力攪拌條件下消化，待無明顯的軟骨組織塊時終止消化，取消化液置于離心管于1500 r/min離心8分鐘，棄上清，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基4 ml重懸細胞，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，靜置于恒溫37℃、CO2體積分數5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔三天更換1次培養(yǎng)液，按時在倒置顯微鏡下觀察、拍照，當細胞增殖至瓶底80%左右時按適當比例傳代培養(yǎng)。

1.4 分組

實驗組為10 μm黃連堿與P3代大鼠軟骨細胞共培養(yǎng)；對照組為P3代大鼠軟骨細胞普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 觀察指標及實驗步驟

1.5.1 鏡下觀察軟骨細胞生長情況及細胞形態(tài) 實驗組為含黃連堿(10 μm)的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液與大鼠關節(jié)軟骨細胞(P3代)5×104在六孔板中共培養(yǎng)，對照組將大鼠關節(jié)軟骨細胞5×104在含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液的六孔板中培養(yǎng)。在37℃飽和濕度及5%二氧化碳細胞孵育箱中分別進行共培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)48小時后觀察細胞生長情況。

1.5.2 MTT檢測 取形態(tài)良好并處于對數生長期的3代軟骨細胞，常規(guī)采用胰酶消化離心后，用含10%胎小牛血清的DMEM培養(yǎng)液將消化后獲得的細胞稀釋并計數成2.5×106/L后，接種于96孔板中每孔200 μl，培養(yǎng)條件與既往培養(yǎng)條件一致。分別在第1、3、5、7天時，實驗組和對照組每個時間點各取5個孔，每孔加MTT溶液(5 mg/ml用PBS 配)20 μl。孵育4小時后終止培養(yǎng)，吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞離心后再吸棄培養(yǎng)上清液。分別在孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，檢測波長設定為490 nm并記錄結果[4]。

1.5.3 軟骨細胞TGF-β1 mRNA檢測 將培養(yǎng)7天后的細胞用胰酶消化后離心收集。移入勻漿器中并加入1 ml Trizol，充分研磨后靜置15分鐘，經氯仿萃取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌后加入30 μl DEPC 水溶解提取總RNA，用分光光度儀檢測RNA純度及濃度。反轉錄及擴增過程均按試劑盒說明書步驟進行。反應條件為95℃預變性60秒，采用三步法測定：95℃ 15秒，57℃30秒，72℃ 45秒共計進行40個循環(huán)。TGF-β1引物: 上游引物序列為5’-TTC TCC ACC AAC TAC TGC TTC-3’，下游引物序列為5’-GGT GTC CAG GCT CCA GAT-3’。采用GAPDH作為內參照，根據熒光定量PCR儀顯示的CT值結果，以對照組做參照通過2-ΔΔCt方法計算RQ值并統(tǒng)計分析兩組的相對基因表達差異。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 體外培養(yǎng)軟骨細胞

實驗組和對照組細胞在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48小時后，倒置顯微鏡100倍顯微視野下觀察，兩組培養(yǎng)細胞均未發(fā)現污染及支原體感染跡象，黃連堿共培養(yǎng)組軟骨細胞密集程度明顯高于對照組且形態(tài)良好，見圖1。

圖1 體外培養(yǎng)48小時后軟骨細胞形態(tài)

2.2 MTT測定結果

兩組細胞在體外培養(yǎng)對數生長期第1、3、5、7天均呈明顯上升趨勢，細胞生長第1天兩組無統(tǒng)計學差異，實驗組于第3、5、7天均高于對照組，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明與一定濃度的黃連堿共培養(yǎng)液能夠促進大鼠關節(jié)軟骨細胞促增殖,見表1。

表1 軟骨細胞體外培養(yǎng)MTT檢測結果

注：同一時間點實驗組與對照組相比aP<0.05

2.3 qRT-PCR結果

提取RNA并稀釋100倍后用分光光度儀檢測吸收波長在A260及A280的OD值，求得各樣本的A260/A280比值在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度較高。據A260的OD值計算得RNA濃度。按照試劑盒說明書進行反轉錄及擴增后行熒光定量，獲得CT值，計算RQ值。結果實驗組TGF-β1 mRNA的表達顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 軟骨細胞TGF-β1 mRNA表達qRT-PCR檢測結果

3 討論

依據膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的臨床表現等疾病特點，中醫(yī)將其歸入“痹證”范疇。《諸病源候論·風痹證》曰：“風寒濕三氣雜至，合而為痹，其狀肌肉頑厚或疼痛。”《黃帝內經》對痹癥也進行了詳細的闡述，認為風、寒、濕邪氣侵襲機體、經絡、臟腑，閉阻不散，從而導致關節(jié)疼痛、腫脹、僵直?？梢婏L寒濕邪在痹證發(fā)生發(fā)展過程中的起著至關重要的作用。大量臨床報道采用中醫(yī)藥方法治療本病亦多從祛風濕、止痹痛著手，且取得一定的療效。而臨床常用的痹證驗方干預骨關節(jié)炎軟骨細胞的基礎實驗從多方面證實祛風濕、止痹痛治法的有效性[5]。黃連堿是屬于異喹啉生物堿，這類生物堿主要包括小檗堿、黃藤素、表小檗堿和木蘭堿等[6]。這類生物堿具有多種生物學活性，如抗糖尿病、抗炎和抗氧化的作用[7-9]。目前多數研究都關注于小檗堿的抑制骨吸收作用[10]。藥代動力學研究發(fā)現口服黃連堿也具有其生物學活性[11-12]。日本學者研究發(fā)現黃連堿能夠有效抑制RANKL介導的NFATc1基因的表達，從而抑制破骨細胞的增殖和其骨吸收的活性[13]?；仡櫸墨I發(fā)現與小檗堿和黃藤素相比，對黃連堿的研究相對較少，因此在本研究中研究了黃連堿對軟骨細胞的影響。

TGF-β1是一類具有多種功能的細胞因子，廣泛存在在動物的正常組織細胞內，其中以骨組織中和血小板中的含量最顯著。目前研究發(fā)現TGF-β1是目前多種調節(jié)軟骨細胞增殖分化相關因子中作用最強的，在關節(jié)軟骨的生長和修復中起了關鍵的作用。一方面，TGF-β1具有向軟骨分化的誘導作用，其可以誘導骨髓間充質干細胞像軟骨細胞分化。另一方面，TGF-β1具有促進軟骨細胞增殖分化和分泌細胞外基質的作用。其可以促進軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖，這兩種細胞外基質是構成關節(jié)軟骨的主要成分。本研究發(fā)現，采用含有黃連堿的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)軟骨細胞能夠顯著的增加軟骨細胞TGF-β1的表達，從而增加軟骨細胞外基質的分泌。然而這種促進軟骨細胞TGF-β1表達的機制是否存在劑量依賴和時間依賴關系還需要在進一步的研究中證實。除此以外，還有相關研究證實，TGF-β1的表達增加能夠顯著抑制人軟骨細胞金屬蛋白酶1mRNA基因的表達，刺激人軟骨細胞金屬蛋白酶1組織抑制劑mRNA基因表達，金屬蛋白酶1表達的增高與人骨關節(jié)炎的形成具有密切關系。另外有研究發(fā)現TGF-β1可以顯著抑制軟骨細胞凋亡，其機制是通過TGF-β1信號傳導時細胞膜上的TGF-β受體Ⅰ和TGF-β受體Ⅱ共同參與，并通過受體下游信號分子Smad家族實現的，Smad家族中Smad2和Smad3可抑制軟骨細胞的成熟過程，實際上亦即TGF-β1可以阻止軟骨細胞向成熟方向分化，進而阻止其凋亡發(fā)生。

本研究發(fā)現，黃連堿能夠在體外有效維持關節(jié)細胞的形態(tài)并且促進軟骨細胞的增殖，能夠顯著提高關節(jié)軟骨細胞的TGF-β1的表達。這可能是其治療骨關節(jié)炎的可能機制之一。然而，黃連堿是通過何種機制促進軟骨細胞增殖分化和TGF-β1的表達還需要進一步的研究。

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(本文編輯：秦楠)

EffectofcoptisineonproliferationofratarticularchondrocytesculturedinvitroandmRNAexpressionoftransforminggrowthfactor-beta1

CHENJian-wu,WANGXiao-juan.

MedicalDivisionofXinjiangmilitaryregion,Urumqi830042,China

Correspongdingauthor:WANGXiao-juan,E-mail：wangxiaojuan491@126.com

ObjectiveTo observe the effect of coptisine on the proliferation of rat articularchondrocyte and transforming growth factor-β1 mRNA expression, and then to explore the role and possible mechanism of coptisine in the treatment of osteoarthritis.MethodsKnee cartilage was shredded after harvested from SD rats under sterile conditions, and chondrocytes were isolated and cultured by the way of enzymatic digestion. After identifying by toluidine blue staining, the third-passage cells in the logarithmic growth phase were cultured in vitro and randomly divided into two groups after adherence. The experimental groups were cultured in DMEM with 10 μm coptisine, while the control group was given with normal medium alone. Chondrocytes morphology was observed under an microscope after 48 hours. 1, 3, 5, 7 days later, Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) assay method was adopted to observe the influence of coptisine on the proliferation of chondrocytes.Transforming growth factor-β1 mRNA levels were detected and analysed by quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR) at 7days after cell culture.ResultsThe cell growth intensity in the co-culture group was significantly better than in the control group observed under microscopeafter 48 hours after culture. MTT assay showed that cell proliferation in experimental group were higher than in the control group after 3 days of cell culture.transforming growth factor-β1 mRNA level in the co-culture group weresignificantly better than the control group after 7 days of cell culture.Conclusioncoptisine can promote proliferation of chondrocyte and transforming growth factor-β1 mRNA expression, and these may be one of the possible mechanisms thatcoptisine can work in the treatment of osteoarthritis.

Coptisine； Chondrocyte； Proliferation； Transforming growth factor-β1

830042 烏魯木齊，新疆軍區(qū)聯勤部衛(wèi)生處(陳建武)；解放軍第23醫(yī)院藥械科(王曉娟)

陳建武(1974- )，本科，主治醫(yī)師。研究方向：衛(wèi)生事業(yè)管理。E-mail: chenjianwu491@126.com

王曉娟(1972- )，女，本科，主管藥師。研究方向：藥理研究及臨床應用。E-mail: wangxiaojuan491@126.com

R285.6

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.04.004

2014-01-18)