劉海華 張亞強(qiáng) 李永嵐

目前研究的泌尿系結(jié)石主要是大到一定程度而能通過影像診斷出來的泌尿系結(jié)石，對于影像不能診斷出來的泌尿系微結(jié)石還缺乏研究［1］。李永嵐主任檢驗師創(chuàng)建的早期尿石病診斷法［2］使影像診斷不出來的泌尿系微結(jié)石的診斷成為可能，張亞強(qiáng)教授結(jié)合泌尿系微結(jié)石特點及臨床防治經(jīng)驗，擬創(chuàng)了消微防石湯用于治療泌尿系微結(jié)石以防止其長成影像可見的泌尿系結(jié)石，臨床實踐證明療效確切。本研究旨在通過動物實驗觀察消微防石湯對大鼠腎臟草酸鈣微結(jié)石防治作用并初步探討其防治機(jī)制，為消微防石湯防治泌尿系微結(jié)石的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級健康雄性大鼠72 只，體重(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(京)2012-0001，質(zhì)量合格證單號:NO.11400700005691)，按4 只/籠飼養(yǎng)于公安部物證鑒定中心毒理學(xué)應(yīng)用研究動物實驗室。

1.2 藥物、試劑及儀器

1.2.1 藥物 消微防石湯(組方為金錢草30 g、雞內(nèi)金30 g、川牛膝20 g、蘆根20 g、丹參20 g、陳皮12 g、烏藥10、郁金20 g、茯苓10 g、炒白術(shù)20 g、肉桂3 g、萆薢20 g)由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥劑科根據(jù)原方比例提供生藥并經(jīng)煎藥室分別煎制成消微防石湯低、中、高劑量煎劑(分別相當(dāng)于正常成年人日用量5 倍、10 倍、20 倍)，冷藏備用;復(fù)方金錢草顆粒(批號:120609)由廣西萬通制藥有限公司生產(chǎn)，成份為金錢草、車前草、石韋、玉米須，每袋3 g(相當(dāng)于生藥4.9 g)，正常成人1～2 袋/次、3 次/天，按正常成人日用量(即4.5 袋/天)10 倍藥量用開水溶化成復(fù)方金錢草顆粒溶化液，冷藏備用;0.9% 生理鹽水注射液(生產(chǎn)批號:1307221351)由辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);乙二醇(批號:2013020128)由國藥集團(tuán)北京分公司生產(chǎn)。

1.2.2 試劑 尿液pH 試紙(標(biāo)準(zhǔn)代號:Q/HTZ07-2004)由杭州特種紙業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2.3 儀器 T500 型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)，HG-9602A 氫化物內(nèi)置原子吸收分光光度計(國產(chǎn))，7150 全自動生化儀(日立)，OLYMPUS偏光顯微鏡(日本)。

1.3 分組、造模及給藥

1.3.1 分組 將72 只Wistar 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成六組，設(shè)正常組(12 只)、生理鹽水陰性對照組(12 只)、復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組(12 只)、消微防石湯低劑量實驗組(12 只)、消微防石湯中劑量實驗組(12 只)、消微防石湯高劑量實驗組(12 只)。

1.3.2 造模 將乙二醇用蒸餾水配制成一定濃度，各組大鼠適應(yīng)性休息1 周后，除正常組外，其余各組均用一定量已配制好的乙二醇溶液灌胃，每天上午灌胃1 次，連續(xù)5 天。

1.3.3 給藥 各組大鼠適應(yīng)性休息1 周后，除正常組外，其余各組每天下午按9.62 ml/(kg·d)給予藥物灌胃，連續(xù)5 天，即:生理鹽水陰性對照組給予0.9% NaCl 注射液，復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組給予復(fù)方金錢草顆粒溶化液，消微防石湯低、中、高劑量實驗組分別給予低、中、高劑量消微防石湯。整個過程無大鼠死亡。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 取材 第5 天末次灌藥后，各組均用代謝籠收集12 小時(20:00～8:00)尿液離心取清液并用pH 試紙測pH 值后放入－20℃冰箱待測其它指標(biāo)，稱各組大鼠體重，然后腹腔麻醉，采腹主動脈血離心取血清并放入－20℃冰箱待測，取腎組織稱重后放入4%福爾馬林固定。

1.4.2 腎組織觀察 將腎組織制成腎縱行軟組織定向切片，用偏光顯微鏡觀察，根據(jù)快速草酸鈣動物模型［3］五級分類法，按晶體有無、數(shù)量、聚合度和部位而分為(+ + +)、(+ +)、(+)、(±)、(－)，其中(－)級為成石陰性，(±)、(+)、(+ + )、(+ + +)級為成石陽性。

1.4.3 動脈血清及尿液草酸、鈣、肌酐濃度測定將離心后的動脈血清及尿液送往上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，采用原子吸收檢測方法用HG-9602A氫化物內(nèi)置原子吸收分光光度計(國產(chǎn))檢測草酸，采用比色檢測法用7150 全自動生化儀(日立)檢測鈣、肌酐。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表1完全隨機(jī)設(shè)計多樣本率計數(shù)資料，總體及組間兩兩比較均采用χ2檢驗;表2、3、4 完全隨機(jī)設(shè)計多樣本計量資料，以(±s)表示，總體及組間兩兩比較均采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織成石程度比較

六組大鼠腎組織總體成石率比較，采用Pearson χ2檢驗，P=0.000＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠腎組織總體成石率不全相同，表1中成石率由高到低依次是生理鹽水陰性對照組(87.50%)、消微防石湯低劑量實驗組(79.17%)、復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組(70.83%)、消微防石湯中劑量實驗組(58.33%)、消微防石湯高劑量實驗組(50.00%)、正常組(0.00%);與生理鹽水陰性對照組比較，復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組采用Pearson χ2檢驗、消微防石湯低劑量實驗組采用校正χ2檢驗，分別為P=0.155＞0.05、P=0.699＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，消微防石湯中、高劑量實驗組均采用Pearson χ2檢驗，分別為P=0.023＜0.05、P=0.005＜0.01，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;與復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組比較，消微防石湯低、中、高劑量實驗組均采用Pearson χ2檢驗，分別為P=0.505＞0.05、P=0.365＞0.05、P=0.140＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯高劑量實驗組與中劑量實驗組、中劑量實驗組與低劑量實驗組比較，均采用Pearson χ2檢驗，分別為P=0.562＞0.05、P=0.119＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量實驗組與低劑量實驗組比較，采用Pearson χ2檢驗，P=0.035＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(編者按:本χ2檢驗的兩兩比較，其檢驗水準(zhǔn)P=0.05 未經(jīng)校正，請讀者斟酌看待。)

表1 大鼠各級成石腎組織個數(shù)

2.2 各組大鼠動脈血清草酸、鈣、肌酐濃度比較

六組大鼠動脈血清草酸總體濃度比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.956＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠動脈血清草酸總體濃度全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.862＞0.05、P=0.751＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.908＞0.05、P=0.453＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。六組大鼠動脈血清鈣總體濃度比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.317＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠動脈血清鈣總體濃度全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.453＞0.05、P=0.862＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.862＞0.05、P=0.564＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。六組大鼠動脈血清肌酐總體濃度比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.958＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠動脈血清肌酐總體濃度全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.751＞0.05、P=0.564＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.954＞0.05、P=0.419＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組大鼠尿液pH、草酸、鈣、肌酐濃度比較

六組大鼠尿液總體pH 值比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.436＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠尿液總體pH 值全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.251＞0.05、P=0.559＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.440＞0.05、P=0.518＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。六組大鼠尿液草酸總體濃度比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.896＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠尿液草酸總體濃度全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.862＞0.05、P=0.729＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.525＞0.05、P=0.931＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。六組大鼠尿液鈣總體濃度比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.800＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠尿液鈣總體濃度全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=1.000＞0.05、P=0.371＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.419＞0.05、P=0.583＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。六組大鼠尿液肌酐總體濃度比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.853＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠尿液肌酐總體濃度全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.729＞0.05、P=0.840＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.435＞0.05、P=0.686＞0.05，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 大鼠左、右腎重量及體重比較

六組大鼠左腎總體重量比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.047＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠左腎總體重量不全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.722＞0.05、P=0.005＜0.01，消微防石湯中劑量實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，消微防石湯高劑量實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.787＞0.05、P=0.018＜0.05，消微防石湯中劑量實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，消微防石湯高劑量實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。六組大鼠右腎總體重量比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.007＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠右腎總體重量不全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.806＞0.05、P=0.024＜0.05，消微防石湯中劑量實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，消微防石湯高劑量實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.926＞0.05、P=0.026＜0.05，消微防石湯中劑量實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，消微防石湯高劑量實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。六組大鼠終末體重總體重量比較，采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P=0.000＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明六組大鼠終末體重總體重量不全相同;消微防石湯中、高劑量實驗組與正常組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.005＜0.01、P=0.000＜0.01，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;消微防石湯中、高劑量實驗組與生理鹽水陰性對照組比較，均采用Mann-Whitney U 檢驗，分別為P=0.751＞0.05、P=0.008＜0.01，消微防石湯中劑量實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，消微防石湯高劑量實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 大鼠動脈血清草酸、鈣、肌酐濃度(±s)

表2 大鼠動脈血清草酸、鈣、肌酐濃度(±s)

組別 n 草酸(mg/L) 鈣(mg/L) 肌酐(μmol/L)12 5.6469±1.3250 105.25±14.42 30.10±6.73生理鹽水陰性對照組 12 5.4677±1.6211 99.92±19.74 29.67±6.31復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組 12 5.7013±1.6768 119.96±25.89 30.75±7.01消微防石湯低劑量實驗組 12 5.4901±1.1979 105.23±23.85 30.28±8.07消微防石湯中劑量實驗組 12 5.5563±1.4839 100.56±13.84 29.55±6.58消微防石湯高劑量實驗組正常組12 5.7461±1.3208 105.37±18.42 32.58±8.20

表3 各組大鼠尿液pH、草酸、鈣、肌酐濃度(±s)

表3 各組大鼠尿液pH、草酸、鈣、肌酐濃度(±s)

組別 n pH 草酸(mg/L) 鈣(mg/L) 肌酐(μmol/L)正常組 12 6.8±1.0 28.3540±5.8202 50.33±9.97 11.45±3.42生理鹽水陰性對照組 12 6.6±0.5 27.4761±8.3472 48.51±15.51 11.47±1.99復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組 12 6.6±0.8 26.5220±8.8766 51.73±16.25 11.15±1.78消微防石湯低劑量實驗組 12 6.2±0.7 27.4862±7.0634 48.45±10.91 11.03±1.76消微防石湯中劑量實驗組 12 6.4±1.0 28.6484±7.2735 50.15±10.89 11.87±3.20消微防石湯高劑量實驗組 12 6.5±0.8 28.0749±7.0557 48.12±12.59 11.91±2.09

表4 大鼠左、右腎重量及終末體重(±s)

表4 大鼠左、右腎重量及終末體重(±s)

組別 n 左腎(g) 右腎(g)終末體重(g )12 1.1±0.1 1.1±0.1 271±16生理鹽水陰性對照組 12 1.1±0.1 1.1±0.1 251±17復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組 12 1.1±0.1 1.1±0.1 251±23消微防石湯低劑量實驗組 12 1.1±0.1 1.2±0.2 254±23消微防石湯中劑量實驗組 12 1.1±0.1 1.1±0.1 250±16消微防石湯高劑量實驗組__正常組12 1.0±0.1 1.0±0.1 228±18__

3 討論

泌尿系結(jié)石是泌尿外科常見疾病，隨著生活方式及飲食習(xí)慣等改變，全球發(fā)病率有增高趨勢，一方面是因為結(jié)石的發(fā)生確實增加，另一方面是影像檢查的普及使得更多無癥狀結(jié)石得以發(fā)現(xiàn)［4］。泌尿系結(jié)石成石機(jī)制尚未完全清楚［5］，如何預(yù)防泌尿系結(jié)石是值得逐步探討和解決的命題，早期發(fā)現(xiàn)并積極治療以防止結(jié)石繼續(xù)長大是目前泌尿系結(jié)石預(yù)防的可行舉措。

中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院劉猷枋教授認(rèn)為氣滯血瘀是泌尿系結(jié)石病機(jī)之一，治療時主張行氣破血，擬創(chuàng)的化瘀尿石湯［6］用于治療影像可見的泌尿系結(jié)石，二十多年臨床與實驗驗證其療效確切。李永嵐老師創(chuàng)建了早期尿石病診斷法，通過偏光顯微鏡能檢查出影像檢查不出來的泌尿系微結(jié)石，使得泌尿系微結(jié)石早期發(fā)現(xiàn)成為可能。治未病是中醫(yī)藥優(yōu)勢，張亞強(qiáng)教授認(rèn)為治療泌尿系微結(jié)石病時應(yīng)標(biāo)本同治，去標(biāo)而不傷正，顧本而重脾腎，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗擬創(chuàng)了消微防石湯，清熱祛濕利尿兼以行氣活血以加強(qiáng)排石之功，同時佐以健脾祛濕、益腎化濁以標(biāo)本兼顧，實踐證明其能有效促使泌尿系微結(jié)石排出以防止其繼續(xù)長大成影像可見的泌尿系結(jié)石。

消微防石湯由金錢草、雞內(nèi)金、川牛膝、蘆根、丹參、陳皮、烏藥、郁金、茯苓、白術(shù)、肉桂、萆薢12 味中藥組成，在清熱祛濕、利尿排石基礎(chǔ)上加予行氣活血、健脾益腎;復(fù)方金錢草顆粒由金錢草、車前草、石葦、玉米須4 味清熱祛濕、利尿排石藥組成，選其作為消微防石湯陽性對照組。消微防石湯中、高劑量實驗組成石率分別低于復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組12.50%、20.83%，與復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組比較，消微防石湯低、中、高劑量實驗組差異雖然均無統(tǒng)計學(xué)意義(三組均P＞0.05)，但與生理鹽水陰性對照組比較，復(fù)方金錢草顆粒陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而消微防石湯中、高劑量實驗組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)，故可說明中、高劑量消微防石湯防治大鼠腎臟草酸鈣微結(jié)石作用確切且較復(fù)方金錢草顆粒好，治療泌尿系微結(jié)石病應(yīng)在清熱祛濕、利尿排石時兼以行氣活血、健脾益腎。

有學(xué)者對單味中藥或中藥方劑防治泌尿系結(jié)石作用機(jī)制作了些研究。如金錢草、石葦、車前子是治療泌尿系結(jié)石常用藥，有研究證實單味中藥金錢草、石葦、車前子均可增加大鼠尿中草酸鈣晶體排出，對預(yù)防大鼠腎結(jié)石形成均有確切效果［7］;復(fù)方金錢草顆粒是治療泌尿系結(jié)石常用中成藥，有人研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方金錢草顆?？梢栽黾哟笫竽蛄?、減輕輸尿管張力、抗炎及保護(hù)腎功能［8］。本研究顯示，六組大鼠動脈血清與尿液中肌酐總體濃度均無顯著性差異(P＞0.05)，可能由于腎臟草酸鈣微結(jié)石程度較輕而尚未明顯影響腎功能，故肌酐總體濃度無差別。消微防石湯中、高劑量實驗組分別與生理鹽水陰性對照組比較，成石率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)，而消微防石湯中、高劑量實驗組大鼠尿液pH值及動脈血清與尿液中草酸、鈣濃度與正常組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與生理鹽水陰性對照組比較，差異亦均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明中、高劑量消微防石湯可能不是通過影響大鼠尿液pH 值及動脈血清與尿液中草酸、鈣濃度以致影響草酸鈣晶體的形成來發(fā)揮對大鼠腎臟草酸鈣微結(jié)石的防治作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討，有可能是通過影響草酸鈣晶體的附著、排出而使腎組織草酸鈣晶體減少。

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