王旭昀 李海松 張宏 黨進

右歸丸是張景岳根據(jù)《難經(jīng)》“陰中求陽”的理論所創(chuàng)，具有溫補腎陽，填精補血的作用，右歸膠囊是在右歸丸基礎上開發(fā)出的一種新劑型，藥物成分、適應癥和右歸丸完全相同，對腎陽不足、腎精虧虛癥所導致的不育有較好的臨床療效。目前尚未有實驗研究來證實右歸膠囊對腎陽虛男性不育癥的治療作用。本實驗從大鼠生殖性腺的重量及組織形態(tài)學變化兩方面觀察了右歸膠囊對腺嘌呤致腎陽虛不育模型大鼠生殖功能的影響，探討其治療男性不育癥的機制所在，為臨床應用提供了實驗依據(jù)，現(xiàn)匯報如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠45 只，育齡3 個月左右，清潔級，體重(300±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，公司許可證號:SCXK(京)2006-0009，批號:20090316。大鼠飼養(yǎng)及實驗均在清潔級動物實驗室北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科技發(fā)展中心實驗動物中心進行，合格證號:SYXK(京)2006-0012。清潔飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司供給。

1.2 實驗試劑與藥品

右歸膠囊:由江西銀濤藥業(yè)有限公司提供(國藥準字Z20030134，生產(chǎn)批號:1002005);腺嘌呤(Adenine):由國藥集團化學試劑公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號20090107);上述藥品臨用前混懸于0.5%的羧甲基纖維素(caboxy methyl cellulose，CMC)中灌胃;羧甲基纖維素鈉:由北京化學試劑有限責任公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號:3405005)氯化鉀、果糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、Bouins 液、無水乙醚、無水乙醇、磷酸二氫鈉、氯化鈉等，均由國藥集團化學試劑公司生產(chǎn)。

1.3 實驗儀器

DL-8R 冷凍離心機:深圳天南海北實業(yè)有限公司產(chǎn)品;細胞計數(shù)器:上海醫(yī)用光學儀器廠;Olympus BX60 熒光顯微鏡:日本產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物的分組及給藥方法

購入3 個月齡左右SD 雄性大鼠45 只，將大鼠置于清潔級動物室中，動物室室溫28℃、濕度65%，自由進食飲水適應1 周后，按照隨機數(shù)字表法將其分為正常組、模型組、右歸組，每組15 只。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，0.5%羧甲基纖維素鈉(10 ml/kg)灌胃，4小時后給予10 ml/kg 的蒸餾水灌胃;模型組常規(guī)喂養(yǎng)，0.5%羧甲基纖維素鈉(10 ml/kg)灌胃，4 小時后0.5%羧甲基纖維素鈉配制后的腺嘌呤(10 ml/kg)灌胃(每ml 含腺嘌呤25 mg);右歸組常規(guī)喂養(yǎng)，0.5%羧甲基纖維素鈉配置的“右歸膠囊”(10 ml/kg)、每ml 含右歸膠囊154.3 mg(1543 mg/kg)灌胃(人體用量的20 倍);4 小時后用0.5%羧甲基纖維素鈉配制后的腺嘌呤(10 ml/kg)灌胃(每ml 含腺嘌呤25 mg)。以上操作每日1 次，共30 天。實驗期間每5天稱體重1 次，調(diào)整給藥量。給藥量按人和動物體表面積計算公式計算。

實驗及取材過程中，正常組大鼠死亡4 只，模型組大鼠死亡5 只，右歸組大鼠死亡4 只，故三組最終有效例數(shù)分別是正常組11 只、模型組10 只、右歸組11 只。

2.2 實驗動物的處理

給藥后第30 天將每組大鼠于末次給藥1 小時后在安靜狀態(tài)下用10%水合氯醛麻醉;取血后立即取出雙側(cè)睪丸、附睪、前列腺+精囊腺電子天平稱重;右側(cè)睪丸用睪丸用Bouins 液(苦味酸飽和液75 ml、甲醛25 ml、冰醋酸5 ml 配制)固定，24 小時后脫水，包埋，制塊，切片5 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組大鼠睪丸曲細精管形態(tài)及精子發(fā)生狀態(tài)。

2.3 測定指標和方法

2.3.1 組織重量測定 于末次給藥1 小時后處死大鼠，立即以YB 型電子天平測量大鼠睪丸、附睪、精囊腺的重量。

2.3.2 組織形態(tài)學觀察 取出已固定的睪丸解剖標本、睪丸矢狀斷面標本，取組織緩沖液中后固定，按病理學常規(guī)方法脫水、透明、包埋、切片(5 μm厚)，蘇木素-伊紅(HE)染色;光鏡下觀察各實驗組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)有無病變，同時觀察各組大鼠睪丸生精小管結(jié)構(gòu)、排列密度、曲細精管內(nèi)各級精原細胞數(shù)量、生精細胞排列層次及精子數(shù)量等組織結(jié)構(gòu)變化。

2.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)應用SAS 8.2 統(tǒng)計軟件分析。計量資料數(shù)據(jù)采用(±s)表示，方差齊性檢驗采用Levene 檢驗，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較采用LSD-t 法，P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計學意義。為保證檢測指標的客觀真實性，統(tǒng)計數(shù)據(jù)時剔除不符合正態(tài)分布原則的界外值。

3 結(jié)果

3.1 右歸膠囊對腎陽虛不育模型大鼠生殖器官重量的影響

以腺嘌呤混懸液為灌胃藥物，誘發(fā)腎陽虛不育模型大鼠，經(jīng)右歸膠囊灌胃治療后，各組大鼠生殖器官重量存在著顯著的差異。右歸組大鼠左側(cè)睪丸、右側(cè)睪丸，左側(cè)附睪、右側(cè)附睪，前列腺+精囊重量均低于正常組大鼠但高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義。五組數(shù)據(jù)組間比較均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較均采用LSD-t 法，結(jié)果見表1。

3.2 右歸膠囊對腎陽虛不育模型大鼠睪丸組織形態(tài)學的影響

3.2.1 肉眼觀察 正常組大鼠睪丸體積基本正常，表面光滑，可見血管走行;模型組大鼠睪丸體積明顯縮小;大部分右歸組大鼠睪丸體積恢復近至正常。

3.2.2 光鏡觀察睪丸組織病理學變化 正常組大鼠睪丸曲細精管排列規(guī)則整齊，各級生精細胞發(fā)育良好，數(shù)量正常，層次分明，管腔內(nèi)可見成熟精子，管壁邊界整齊，基膜薄，睪丸間質(zhì)細胞數(shù)目及形態(tài)正常，未見變性及壞死等病變(圖1A、B);模型組大鼠睪丸曲細精管明顯萎縮，各級生精細胞明顯減少，部分脫落，支持細胞相對增多，管腔內(nèi)精子明顯減少(圖1C、D)，曲細精管之間的結(jié)締組織增多，間質(zhì)細胞數(shù)目亦明顯減少;右歸組大鼠睪丸曲細精管萎縮明顯減輕，各級生精細胞、精子數(shù)量及間質(zhì)細胞數(shù)量較模型組增多(圖1E、F)。由上可知，右歸組大鼠睪丸曲細精管萎縮明顯減輕，各級生精細胞、精子數(shù)量及間質(zhì)細胞數(shù)量較模型組增多，表明右歸膠囊對腺嘌呤致腎陽虛不育有較好的治療作用。

4 討論

4.1 實驗動物的選擇及模型制備評價

SD 大鼠體型較大，適宜做生殖器官的損傷修復等實驗，常用于計劃生育方面的研究。本實驗為男性不育癥研究，動物模型為生精細胞損傷，故在本實驗中選擇3月齡SD 雄性大鼠為受試動物。腺嘌呤誘發(fā)腎陽虛不育模型大鼠，一方面可直接損傷睪丸使精子數(shù)目減少，另外一方面可直接或間接地引起大鼠其它生殖腺組織損傷、功能損害，從而導致精液質(zhì)量變差，已有相關文獻指出腺嘌呤灌胃或者喂養(yǎng)動物能夠誘導理想的腎陽虛睪丸功能損害模型［1］。此外，腺嘌呤誘導的腎陽虛不育模型大鼠血清睪酮水平偏低，雌二醇偏高［2］，因此從形態(tài)學表現(xiàn)及反映生殖系統(tǒng)改變的各項指標上來看，腺嘌呤誘導的腎陽虛不育模型最優(yōu)。

本實驗采用腺嘌呤灌胃復制腎陽虛不育模型大鼠較為成功，具體表現(xiàn)如下:(1)睪丸病理切片發(fā)現(xiàn)模型組大鼠睪丸曲細精管明顯萎縮，各級生精細胞明顯減少，部分脫落，支持細胞相對增多，管腔內(nèi)精子明顯減少，曲細精管之間的結(jié)締組織增多，間質(zhì)細胞數(shù)目亦明顯減少，表明不育模型的成功。(2)模型組大鼠大部分于給藥第十天出現(xiàn)擁擠在一起，萎靡不振、畏寒怕冷、反應遲鈍等現(xiàn)象;后逐漸出現(xiàn)皮毛無光澤、飲食減少、腹部皮毛、尾巴潮濕、耳廓蒼白、瞇眼、眼瞼周圍浮腫、豎毛、多尿等類似腎陽虛的癥狀，且癥狀隨給藥日數(shù)增加而加劇，表明腎陽虛模型的成功。

表1 各組大鼠睪丸、附睪、精囊腺+前列腺重量的比較(±s)

表1 各組大鼠睪丸、附睪、精囊腺+前列腺重量的比較(±s)

注:與正常組比較aP＜0.05，bP＜0.01;與模型組比較cP＜0.01

組別例數(shù) 右側(cè)睪丸重量(g) 左側(cè)睪丸重量(g) 右側(cè)附睪重量(g) 左側(cè)附睪重量(g) 精囊+前列腺重量(g)正常組 11 1.57±0.19 1.55±0.23 0.53±0.06 0.54±0.09 2.03±0.49模型組 10 0.90±0.27b 0.91±0.28b 0.31±0.11b 0.29±0.09b 0.46±0.13b右歸組 11 1.30±0.25ac 1.30±0.24ac 0.42±0.08bc 0.43±0.09bc 0.95±0.37 bc

圖1 各組給藥后第30 天大鼠睪丸組織HE 染色

4.2 右歸膠囊對腎陽虛不育模型大鼠生殖功能的影響及機制探討

本實驗發(fā)現(xiàn)右歸組大鼠睪丸、附睪、精囊腺+前列腺重量之和較模型組有明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義，這一點與文獻報道一致［3］。睪丸、附睪、精囊腺及前列腺的發(fā)育有賴于雄激素的支持，提示右歸膠囊有雄激素樣作用。

模型組大鼠睪丸病理切片示曲細精管明顯萎縮，各級生精細胞明顯減少、部分脫落，支持細胞相對增多，管腔內(nèi)精子明顯減少，曲細精管之間的結(jié)締組織增多，間質(zhì)細胞數(shù)目亦明顯減少;右歸組大鼠睪丸曲細精管萎縮明顯減輕，各級生精細胞、精子數(shù)量及間質(zhì)細胞數(shù)量較模型組增多。表明右歸膠囊能有效防止腺嘌呤對曲細精管及各級生精細胞的損傷，與文獻報道一致［4-5］。這可能是右歸膠囊治療腎陽虛男子不育癥的一個機理所在，而右歸膠囊對間質(zhì)細胞的保護作用可能是其雄激素樣作用的機制所在。

總之，右歸膠囊可明顯提高大鼠睪丸、附睪、精囊腺、前列腺重量，特別是對附睪的影響，為精子的發(fā)生、成熟提供了較好的環(huán)境，是其治療男性不育癥的一個機制所在。右歸膠囊直接作用于睪丸曲細精管、保護生精細胞，促進精子的發(fā)生和發(fā)育，亦是其治療男性不育癥的一個重要機制。

［1］傅曉晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作腎陽虛型慢性腎功能衰竭模型大鼠的生化研究［J］.福建中醫(yī)學院學報，2003，13(1):22-24.

［2］沈皓，蔡德培，陳伯英.補腎中藥對下丘腦—垂體促性腺機能的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學報，2004，2(1):53-57.

［3］戈士文，高元法，鄧占元，等.五子衍宗濃縮丸主要藥效學的實驗研究［J］.中醫(yī)研究，2003，16(5):19-20.

［4］李春生，張國璽，石體仁，等.山茱萸水提取物對腎陽虛動物模型肝臟和睪丸影響的實驗研究［J］.中國中藥雜志，2003，28(8):743-745.

［5］王德俊，梁虹，孫云.肉蓯蓉對腺嘌呤損傷大鼠精子生成的影響［J］.中國藥理學會通訊，2000，17(4):47-48.