（廣西柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006）

黃體酮注射液無(wú)菌檢查方法的改進(jìn)及驗(yàn)證

韋永樸

（廣西柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006）

目的 對(duì)黃體酮注射液無(wú)菌檢查方法進(jìn)行改進(jìn)并驗(yàn)證。方法 按《中國(guó)藥典》2010 年版二部無(wú)菌檢查法的有關(guān)要求，采用封閉式薄膜過(guò)濾器過(guò)濾，最后用大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉對(duì)所采用的方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 黃體酮注射液采用封閉式薄膜過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌檢查，所用的各驗(yàn)證菌均生長(zhǎng)良好。結(jié)論 改進(jìn)后的方法重現(xiàn)性好，穩(wěn)定、可靠，可作為黃體酮注射液的無(wú)菌檢查方法。

黃體酮注射液；無(wú)菌檢查；方法改進(jìn)及驗(yàn)證

黃體酮注射液為黃體酮的滅菌油溶液，收載于《中國(guó)藥典》2010年版二部，臨床常肌內(nèi)注射，用于月經(jīng)失調(diào)，如閉經(jīng)和功能性子宮出血、黃體功能不足、先兆流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)（因黃體不足引起者）、經(jīng)前期緊張綜合征的治療[1]。根據(jù)其制法和給藥途徑，按《中國(guó)藥典》2010年版二部要求應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌檢查[1]。近年來(lái)我們?cè)趶V西柳州、來(lái)賓2市轄區(qū)內(nèi)抽驗(yàn)的國(guó)家基本藥物中發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)黃體酮注射液產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)所提供的無(wú)菌檢查方法是直接接種法（即按藥典無(wú)菌檢查要求取樣品直接加入含有1%聚山梨酯80的培養(yǎng)基中），按該方法操作時(shí)，存在以下弊端：①由于培養(yǎng)管和硅膠塞密封性不很理想，培養(yǎng)過(guò)程中易染菌；②樣品不溶于水，浮于培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基表面形成一層膜，易產(chǎn)生厭養(yǎng)境況，不利于需養(yǎng)菌生長(zhǎng)，易誘發(fā)假陰性可能；③不符合《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄Ⅺ H無(wú)菌檢查法提出“只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法”[1]的要求。本文改用薄膜過(guò)濾法，采用封閉式薄膜過(guò)濾器進(jìn)行試驗(yàn)及方法驗(yàn)證，結(jié)果符合《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄Ⅺ H無(wú)菌檢查法有關(guān)規(guī)定，方法穩(wěn)定、可靠。

1 實(shí)驗(yàn)試藥、儀器及設(shè)施

1.1 樣品

黃體酮注射液，浙江仙據(jù)制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：110403、100911、110306由本單位業(yè)務(wù)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]均由本單位生測(cè)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

硫乙醉酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂（均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)）。

1.4 稀釋劑

pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。

1.5 儀器及設(shè)施

封閉式集菌培養(yǎng)器（PY330、PY220）、智能集菌儀、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、生物安全柜、高壓滅菌鍋、旋渦混合器、電熱干燥箱、環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域等。

2 方法和結(jié)果

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌[CMCC（B）44 102] 第3代、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]第3代、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]第3代的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含50～100 cfu的菌懸液；接種生孢梭菌[CMCC（B）64941] 第3代新鮮培養(yǎng)物至硫乙醉酸鹽流體培養(yǎng)基33 ℃培養(yǎng)18～24 h；用硫乙醉酸鹽流體培養(yǎng)基制成每1 mL含50～100 cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)7 d，加入10 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子50～100 cfu的孢子懸液。備用[2,3]。

2.2 供試液制備

取供試品30支，加入約100 mL含有1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中充分混合，制成供試液。

2.3 方法及驗(yàn)證

取上述供試液用杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的PY330全封閉集菌培養(yǎng)器，經(jīng)智能集菌儀進(jìn)行過(guò)濾，抽干，再用100 mL含有1%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，濾凈，然后每個(gè)培養(yǎng)器內(nèi)灌注100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，同法制成改良馬丁培養(yǎng)基2管，上述5管作為試驗(yàn)組；另取3個(gè)兩聯(lián)集菌培養(yǎng)器，每個(gè)直接灌注100 mL培養(yǎng)基（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3管，改良馬丁培養(yǎng)基2管），作為陽(yáng)性對(duì)照組。然后上述兩組分別加入＜100 cfu的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉每間組各一管；另取一個(gè)兩聯(lián)集菌培養(yǎng)器，取20 mL稀釋劑代替供試液按上述方法同法操作，過(guò)濾抽干后，一管加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，另一管加入100 mL改良馬丁培養(yǎng)基，做為陰性對(duì)照。最后把各硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基集菌培養(yǎng)器置于33 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，把各改良馬丁培養(yǎng)基集菌培養(yǎng)器置于25 ℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果的比較

從上述3個(gè)批號(hào)樣品的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果看，6種驗(yàn)證菌在試驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組中均生長(zhǎng)良好，符合《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄Ⅺ H的要求，方法可行。

按上述擬定的黃體酮注射液無(wú)菌檢查方法，對(duì)三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，以考查該方法的可靠性及重現(xiàn)性，結(jié)果見表2。

3 討 論

表2 樣品檢驗(yàn)結(jié)果的比較

試驗(yàn)結(jié)果表明：改進(jìn)后的方法完全符合《中國(guó)藥典》2010年版二部規(guī)定的無(wú)菌檢查法的要求，方法穩(wěn)定、可靠。可避免直接接種法存在的各種隱患，可作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版.二部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M]. 2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[3] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社, 2000.

Method Study to Improve The Method for Sterility Test of Progesterone Injection

WEI Yong-pu
(Liuzhou Food and Drug Control in Guangxi Zhuang Autonomous Region, Liuzhou 545006, China)

Objective A method study to improve the method for sterility test of progesterone injection. Methods According to the sterility test in Chinese Pharmacopoeia(2010 edition, VolumeⅡ), filter with the enclosed membrane filter, and using the Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Clostridium Sporogenes, Candida albicans, Aspergillus niger to verifying the method that is uesed. Result Adopt the enclosed membrane filter to do the sterility test of progesterone injection, and all the verification bacteria grow well. Conclusion This improved method is stabilization, credibility, reproducible and suitable for the sterility text of progesterone injection.

Progesterone injection; Sterility test; Method improvement

R927

：B

：1671-8194（2014）30-0033-02