劉 琳，郝曉明，董 會，歐 元，趙興春，葉 健

（1.中國人民公安大學，北京100038；2.重慶市公安局巴南區(qū)分局，重慶401320；3.法庭科學生物芯片工程實驗室，北京 100038；4.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

自20世紀90年代以來，以PCR-STR技術為代表的第二代法醫(yī)DNA分型技術在司法實踐中的應用日益廣泛，整個DNA分型過程包括DNA提取、定量、PCR擴增和電泳檢測與分析，其中DNA提取與PCR擴增是兩個重要的限速步驟，常規(guī)方法難以滿足DNA數據庫規(guī)模不斷擴大和緊急案件檢驗的需求。本文選用AmpF?STRIdentifilerPlus試劑盒與TaKaRa公司的快速PCR試劑盒聯(lián)合建立快速直接PCR（Rapid Direct PCR[1]）反應體系，采用免提取的方式，以FTA血卡為模板，采用經優(yōu)化的熱循環(huán)參數在快速PCR儀上完成擴增，對如何縮短DNA分型檢測的時間進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 樣本

FTA血卡樣本（公安部物證鑒定中心提供）

1.2 主要儀器及試劑

1.3 PCR擴增方法

1.3.1 快速直接PCR擴增

實驗分為四組，第一組：10 μL反應體系，直徑0.5 mm FTA血卡為模板；第二組：10 μL反應體系，直徑1.0mm FTA血卡為模板；第三組：20 μL反應體系，直徑0.5 mm FTA血卡為模板；第四組：20 μL反應體系，直徑1.0mm FTA血卡為模板。

四組所用熱循環(huán)參數：95℃ 3 min；95℃ 10 s，59℃ 15 s，72℃ 20 s，29 個循環(huán)；72℃ 3 min；25℃保存。擴增總用時55min。

1.3.2 常規(guī)直接PCR擴增

1.4 電泳及數據分析

取上述各PCR擴增產物1μL分別與10μL上樣混合物（20μL GeneScan LIZ500內標 +1000μL去離子甲酰胺）混合，用3130XL遺傳分析儀，按標準流程進行電泳分離，采用GeneMapper ID V 3.2軟件進行基因分型。

圖1 10μL反應體系，直徑0.5mm FTA血卡為模板

2 結果與討論

如何縮短DNA分型檢測時間一直是法醫(yī)界學者們研究的焦點之一，例如，Verheij[2]等在 2012年將Thermo快速PCR試劑盒與AmpF?STRSGM PlusTM、AmpF?STRIdentifiler、AmpF?STRSEfilerPlusTM、AmpF?STRNGMTM分別組合，探索快速直接PCR擴增在法庭科學領域的應用。

圖2 10μL反應體系，直徑1.0mm FTA血卡為模板

圖3 20μL反應體系，直徑0.5mm FTA血卡為模板

3 結論

參考文獻：

[1]Aboud M，Oh HH，McCord B.Rapid Direct PCR for Forensic genotyping in under 25 minutes[J].Electrophoresis，2013，34（11）：1539-1547.

[2]Verheij S， Harteveld J， Sijen T.A protocol for direct and rapid multiplex PCR amplification on forensically relevant samples[J].Forensic Science International： Genetics， 2012，6（2）：167-75.