李晨龍，賈建偉，李秋偉

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合Ⅰ科，天津 300192）

鮮生地（凍干粉）對(duì)肝損傷模型大鼠腸生物屏障的影響*

李晨龍1，賈建偉2，李秋偉2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合Ⅰ科，天津 300192）

[目的]探討鮮生地（凍干粉）對(duì)肝損傷模型大鼠腸生物屏障的影響。[方法]采用Pringle’s maneuver法制作大鼠肝缺血再灌注損傷模型。將64只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鮮生地（凍干粉）組及乳果糖組。觀察大鼠糞便球桿菌比例、菌落培養(yǎng)，測定血清內(nèi)毒素水平。[結(jié)果]鮮生地組、乳果糖組糞便中益生菌增加，大腸桿菌減少，血清內(nèi)毒素水平降低。[結(jié)論]鮮生地能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，降低血內(nèi)毒素水平，可能通過改善腸生物屏障，使肝細(xì)胞得到恢復(fù)。

鮮生地；肝損傷；生物屏障

中藥生地具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之功效。鮮生地質(zhì)更潤，清熱涼血、養(yǎng)陰生津作用更強(qiáng)。在之前的鮮生地系列研究中發(fā)現(xiàn)，鮮生地能改善慢性重型肝炎早/中期（營分證）患者腹脹、口干、煩熱等癥狀，降低患者血清內(nèi)毒素（ET）水平，減輕內(nèi)毒素血癥對(duì)肝臟的“二次打擊”[1]，并對(duì)其降低內(nèi)毒素血癥的機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究擬建立大鼠肝損傷模型，以乳果糖為對(duì)照，觀察鮮生地（凍干粉）對(duì)肝損傷模型大鼠腸生物屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 鮮生地由河南武陟縣采購，真空凍存保鮮，去皮后榨汁制備成凍干粉冷藏備用。乳果糖由北京韓美藥品有限公司提供。內(nèi)毒素測定試劑盒由上海醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)所提供。雙歧桿菌培養(yǎng)基（TPY）、乳酸桿菌培養(yǎng)基（MRSA）、大腸桿菌培養(yǎng)基（EMB）由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD大鼠64只（天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供），體質(zhì)量200～220 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃、濕度55%～65%，每日光照12 h。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鮮生地（凍干粉）組（簡稱鮮生地組）和乳果糖組4組，每組16只，雌雄各半。給藥3 d后造模，手術(shù)前禁食12 h，自由飲水。每日上午9:00和下午4:00，假手術(shù)組、模型組按7.5 mL/kg生理鹽水灌胃，給藥組分別給予7.5 mL/kg相應(yīng)藥物灌胃，處死前1 d停藥。于24 h、48 h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)各組取8只大鼠，留取標(biāo)本后處死。

1.3 模型制作 采用Pringle’s maneuver法[2]建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型（HIRI）。腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，經(jīng)上腹正中斜切口，解剖肝—十二指腸韌帶，除假手術(shù)組外，其余組用無創(chuàng)血管夾夾閉第一肝門部（包括肝動(dòng)脈、門靜脈和膽管）。夾閉期間，間斷向腹腔注射總量約15～20 mL/kg等滲鹽水，以預(yù)防或減輕在松開動(dòng)脈夾后出現(xiàn)的一過性低血容量反應(yīng)，30 min后取出血管夾，恢復(fù)血供。造模成功標(biāo)志為夾閉后肝臟缺血顏色變深、腫脹，腸管瘀血，顏色變深；松開血管夾恢復(fù)血運(yùn)，肝臟及腸管顏色逐漸恢復(fù)。腹部切口縫合。分別于再灌注后24 h、48 h麻醉下腹腔切開，收集結(jié)腸內(nèi)糞便、采集門靜脈血。

1.4 糞便涂片檢測 采用無菌容器留取新鮮糞便，取無菌棉簽挑取糞便以30°～40°角均勻速度推片，面積約1.0 cm×2 cm～1.5 cm×2 cm左右，待自然干燥后固定，行革蘭染色，在100（物鏡）×10（目鏡）倍油鏡下觀察記錄。觀察革蘭陽性桿菌（G+b）、革蘭陰性桿菌（G-b）、革蘭陽性球菌（G+c）、革蘭陰性球菌（G-c）比例。

1.5 細(xì)菌培養(yǎng) 采集新鮮糞便標(biāo)本2份分別置入無菌試管和無氧試管立即送細(xì)菌室，取新鮮糞便0.2 g加入0.9 mL的生理鹽水，在振蕩器上使之勻漿，標(biāo)本按10倍連續(xù)稀釋法至10-9，分別取10-1、10-3、10-5、10-7、10-9稀釋液0.01 mL分別接種于用于選擇性培養(yǎng)基上。選擇具有代表性的大腸桿菌（E.coli）、乳酸桿菌（LB）及雙歧桿菌（BB）的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每種稀釋度接種3滴，計(jì)數(shù)時(shí)取其菌落的平均數(shù)。將MRSA、TPY培養(yǎng)基置入?yún)捬豕拗?，放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋封閉，再放入37℃的孵育箱中培養(yǎng)48h，將EMB培養(yǎng)基直接放在37℃孵育箱中培養(yǎng)24 h，即可完成。結(jié)果以每克糞便濕質(zhì)量中菌落形成單位的對(duì)數(shù)值表示（log CFU/g）。每mL標(biāo)本中活菌集落單位即公式CFU/mL=（標(biāo)本質(zhì)量+稀釋度）/標(biāo)本質(zhì)量×稀釋度×菌落個(gè)數(shù)（或×10）（稀釋度即稀釋倍數(shù)）。

1.6 ET測定 由大鼠門靜脈取血2mL，用干燥無熱源肝素試管收集血液，1 h內(nèi)分離血清，置于-70℃凍存待測定。采用終點(diǎn)顯色法檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組計(jì)量資料的組間比較采用單因素方差分析，多組率的比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞便球桿菌比例 一般情況下，大鼠球/桿比約為25∶75（即1∶3），將球/桿比≤1∶3定為比例正常，球/桿比＞1∶3定為比例失調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，球/桿比例失調(diào)的大鼠減少，鮮生地組與乳果糖組比較，球/桿比例失調(diào)例數(shù)無明顯差異。見表1。由于各組大鼠較少，各組間χ2檢驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 各組大鼠球/桿比例比較Tab.1 Comparison of the ratio between cocci and bacilli in rats’feces 只（%）

2.2 糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌菌落 與假手術(shù)組比較，模型組大腸桿菌明顯升高，乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），鮮生地組與乳果糖組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腸道3種細(xì)菌的菌落比較（±s）Tab.2 Comparison of three bacterial colonies in each group（±s） log CFU/g

表2 各組大鼠腸道3種細(xì)菌的菌落比較（±s）Tab.2 Comparison of three bacterial colonies in each group（±s） log CFU/g

注：假手術(shù)組與模型組比較，**P<0.01；鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，*P<0.05。

組別 n 24 h E.coli LB BB假手術(shù)組 8 6.88±0.60 6.96±0.82 2.92±0.38**模型組 8 8.54±0.74 5.65±1.39 2.41±0.50鮮生地組 8 7.89±0.53 7.34±0.89 2.96±0.41*乳果糖組 8 7.85±0.49 7.16±0.60 2.92±0.44*組別 n 48 h E.coli LB BB假手術(shù)組 8 6.82±0.40 6.57±0.73 3.01±0.47**模型組 8 8.23±0.56△5.07±0.91 2.50±0.41鮮生地組 8 7.62±0.33 7.26±1.02 3.01±0.44*乳果糖組 8 7.61±0.6 6.88±1.05 2.94±0.33*

2.3 各組大鼠內(nèi)毒素檢測結(jié)果 模型組大鼠門靜脈血ET含量明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）。鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，其含量明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。鮮生地組與乳果糖組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見表3。

表3 各組大鼠ET含量比較（±s）Tab.3 Comparion of the ET level in each group（±s）EU/mL

表3 各組大鼠ET含量比較（±s）Tab.3 Comparion of the ET level in each group（±s）EU/mL

注：模型組與假手術(shù)組比較，**P<0.01；鮮生地組、乳果糖組與模型組相比，*P<0.05；鮮生地組與乳果糖組相比。

組別 n 24 h 48 h假手術(shù)組 8 0.056±0.013** 0.049±0.011**模型組 8 0.165±0.011 0.163±0.029鮮生地組 8 0.129±0.013* 0.103±0.007*乳果糖組 8 0.126±0.019* 0.113±0.015*

3 討論

地黃為玄參科植物地黃新鮮或干燥的塊根?，F(xiàn)代藥物成分研究表明[3]：水蘇糖是地黃主要的有效活性成分之一，具有潤腸通便、改善腸道微環(huán)境、增殖雙歧桿菌、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用。生物屏障為對(duì)外來菌株有定植抵抗作用的腸內(nèi)正常寄生菌群。腸道微生物為人體最大的細(xì)菌庫，通常情況下，腸道內(nèi)微生物群構(gòu)成一個(gè)對(duì)抗病原體的重要的保護(hù)屏障。當(dāng)微生態(tài)菌群的穩(wěn)定性遭到破壞后，腸道定植抵抗力大為降低，可導(dǎo)致腸道中潛在性病原體（包括條件致病菌）的定植和入侵，亦可導(dǎo)致腸道內(nèi)毒素大量生成。

慢性肝病時(shí)常伴有腸道菌群失調(diào)的發(fā)生，其原因可能與發(fā)病過程中腸蠕動(dòng)減慢、內(nèi)毒素血癥、腸黏膜水腫、低蛋白血癥等有關(guān)。吳仲文等[4]發(fā)現(xiàn)，慢性重型肝炎患者腸道菌群失調(diào)重于慢性肝炎患者，并認(rèn)為腸道菌群失調(diào)的程度與肝炎病情嚴(yán)重程度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中觀察大鼠糞便標(biāo)本中球/桿菌比例及重要菌株菌落計(jì)數(shù)等指標(biāo)，一般不受糞便稀釋或濃縮的影響，其結(jié)果具有較大臨床意義，糞便標(biāo)本直接涂片革蘭氏染色觀察細(xì)菌球/桿比是判斷腸道細(xì)菌失調(diào)的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示鮮生地、乳果糖在預(yù)防和治療腸道菌群失調(diào)方面具有一定的作用。有研究表明，腸道菌群失調(diào)是腸道黏膜生物屏障受損的主要病因臨床應(yīng)用生地后可增加腸道益生菌，從而利于保護(hù)腸黏膜生物屏障改善[6]。

ET是G-細(xì)菌外層結(jié)構(gòu)即磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，能夠引發(fā)強(qiáng)烈炎性反應(yīng)，它是革蘭陰性桿菌致病的啟動(dòng)因子被認(rèn)為是肝損傷發(fā)病機(jī)制的重要促進(jìn)因素[7]。肝病患者長期持續(xù)存在的內(nèi)毒素血癥（ETM）[8-9]，可加劇肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)肝纖維化過程，在肝炎重癥化與慢性化中起著重要的作用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)大鼠肝損傷后，門靜脈血ET水平升高，并顯著高于假手術(shù)組，鮮生地及乳果糖可改善內(nèi)毒素血癥。既往研究已證實(shí)鮮生地對(duì)腸道機(jī)械屏障有保護(hù)作用，可能通過機(jī)械屏障的保護(hù)改善了內(nèi)毒素血癥，本研究證實(shí)了鮮生地對(duì)生物屏障的調(diào)節(jié)作用，亦進(jìn)一步表明了鮮生地改善內(nèi)毒素血癥的機(jī)制可能包括對(duì)腸生物屏障的調(diào)節(jié)。

[1]賈建偉，趙 潔，李秋偉，等.鮮生地對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷的防護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2008，18（6）：362-364.

[2] Ito K，Ozasa H，Horikawa S.Effects of prior splenectomy on remnant liver after partial hepatectomy with Pringle maneuver in rat[J].Liver Int，2005，25（2）：438-444.

[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：82-83.

[4]吳仲文，李蘭娟，馬偉杭，等.慢性重型肝炎患者腸道定植抗力變化的研究[J].中華肝臟病雜志，2001，9（6）：329-331.

[5]Pardo A,Bartolf R,Lorenzo-Zuniga V,et al.Effect of eisapride on intestinalbacterialovergrowth and bacterialtranslocation in cirrhosis[J].Hepatology,2000,31(4):858-863.

[6] Schwiertz A，Jacobi M，F(xiàn)rick JS，et al.Microbiota in pediatric inflammatory bowel disease[J].J Pediatr，2010，7(15):67-74.

[7]高 敏，盧誠震，梁樹人，等.血必凈注射治療肝硬化并發(fā)原發(fā)性腹膜炎療效觀察[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（3）：122-124.

[8]陳 鵬，曹武奎.熱毒清對(duì)急性肝損傷大鼠內(nèi)毒素血癥的影響[J].天津中醫(yī)藥,2013,30(4):228-230.

[9]汪承柏.重視慢性干預(yù)內(nèi)毒素血癥的防治[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2001,11(4):193-194.

[10]劉劍華.厚樸三物湯加味治療慢性重型肝炎內(nèi)毒素血癥的療效觀察[J].天津中醫(yī)藥，2009，26（3）：195-196.

[11]Bourlioux P,Koletzko B,Guarner F,et al.The intestine and its mieroflora are partners for the protection of the host:report on the Danone Symposium’The Intelligent Intestine’,held in Paris,June 14,2002[J].Am J Clin Nutr,2003,78(4):675-683.

[12]Ding LA,Li YS,Li YS,et al.Intestinal barrier damage caused by trauma and Lipopolysaeeharide[J].World J Gastmenterol,2004,10 (16):2373-2378.

Effect of fresh rehmannia(freeze-dried)on intestinal biological barrier in rats with liver injury

LI Chen-long1,JIA Jian-wei2,LI Qiu-wei2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Department of Integrated Chinese and Western Medicine（Division I）,The Second People’s Hospital of Tianjin,Tianjin 300192,China）

[Objective]To explore the effect of fresh rehmannia (freeze-dried)on intestinal biological barrier in liver damaged rats.[Methods]According to the method of Pringle’s maneuver,hepatic ischemia reperfusion was induced in rats.The 64 rats were randomly divided into sham operation group,model group,fresh rehmannia (freeze-dried)group and the lactulose group.We observed the proportion ratio of coccobacillus in rats’feces,cultured the bacterial colony and measured the level of endotoxin.[Results]In fresh rehmannia group and lactulose group the probiotics was increased,escherichia coli was decreased and the level of endotoxin was decreased.[Conclusion]Fresh rehmannia can regulate the intestinal flora,and reduce blood endotoxin level.It may improve the intestinal biological barrier and recover the liver cells.

fresh rehmannia;liver injury;biological barrier

R285.5

：A

：1672-1519（2014）03-0165-03

2013-09-15）

（本文編輯：馬 英，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.13

天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（2010kz12）。

李晨龍（1988-），女，在讀碩士,主要從事病毒性肝炎診治研究。

李秋偉，E-mail：shddelqw@126.com。