冀 雪

（青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島266042）

英國(guó)缺乏光照并且土地酸度過(guò)高，不適合生產(chǎn)傳統(tǒng)葡萄酒，但正是由于其土地酸度才能生產(chǎn)出獨(dú)特的起泡葡萄酒。在加拿大釀酒季，嚴(yán)重的霜凍反而可以幫助生產(chǎn)冰酒。德國(guó)，捷克和奧地利等氣候涼爽的國(guó)家都在嘗試生產(chǎn)這種特別的葡萄酒。但只能隔幾年才能生產(chǎn)，而在加拿大，每年都可以生產(chǎn)這種葡萄酒[1]。

在歐洲國(guó)家，應(yīng)用改造的釀酒工藝有可能大規(guī)模生產(chǎn)帶有地區(qū)特色的洋酒，特別是那些要求高酸度和低香氣的葡萄酒。最理想的方案就是進(jìn)行二次發(fā)酵—乳酸發(fā)酵（MLF）。葡萄酒生產(chǎn)的首要目標(biāo)是減弱酸度，增強(qiáng)生物穩(wěn)定性，改變葡萄酒香氣和口感[2]。迄今為止，利用二次發(fā)酵大約可以生產(chǎn)75%紅葡萄酒和40%白葡萄酒。

1 釀酒工藝中MLF的作用

釀酒過(guò)程中最重要的就是酒精發(fā)酵。在厭氧條件下，酶催化糖降解，主要產(chǎn)生乙醇和CO2，還有琥珀酸、乙酸和乳酸等有機(jī)酸，高級(jí)醇，乙醛，酯和甘油等副產(chǎn)物，這些物質(zhì)會(huì)影響葡萄酒的口味和香氣。此過(guò)程受酵母酸度的影響。

酒精發(fā)酵快結(jié)束時(shí)，可能會(huì)自發(fā)進(jìn)行MLF。二次發(fā)酵主要用于釀造紅葡萄酒，部分用于釀造白葡萄酒和某些水果酒。二次發(fā)酵菌株包括乳酸菌，片球菌和明串珠菌。目前，最有效的MLF菌株是酒類(lèi)酒球菌，該菌株對(duì)酒精和低pH有很好的耐受性。二次發(fā)酵也叫生物脫氧。蘋(píng)果酸口感較酸，而乳酸口感較溫和，生物脫氧是由L(-)蘋(píng)果酸脫羧轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)(+)乳酸和CO2，1 g蘋(píng)果酸能轉(zhuǎn)化成0.67 g乳酸和0.33 g(165 mL)CO2。

酒類(lèi)酒球菌能合成酸，酒精和酯等代謝物除去植物或草本身的氣味，同時(shí)使葡萄酒帶有水果或花的香氣，從而改善葡萄酒的口味、香氣和質(zhì)感。MLF乳酸菌能合成抗菌化合物—類(lèi)細(xì)菌素抑制劑 (BLIS)，可明顯減弱其它乳酸菌的生長(zhǎng)。酒球菌能有效控制乳酸菌產(chǎn)生的多糖，丁二酮，乙酰甲基原醇，醋酸或乙醛等代謝物的量[3]。

2 MLF所需的條件和技術(shù)缺陷

MLF可以獲得所需的酸度和弱芳香氣味。啟動(dòng)MLF需要溫度在20-25℃之間，而在MLF過(guò)程中，就需要溫度介于18-20℃之間，游離SO2濃度低于 10 mg/L，SO2總濃度低于 30 mg/L，pH介于3.2-3.4之間[4]。酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程會(huì)消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此有必要給未熟酒提供C、N和P。

多酚類(lèi)化合物會(huì)影響二次發(fā)酵效果[5]。在梅露汁等葡萄酒品種中發(fā)現(xiàn)了不利于MLF的單寧酸,因此需要減少其含量[6]。并不是所有酚類(lèi)化合物都不利于酒類(lèi)酒球菌的生長(zhǎng)及代謝活性。在釀制過(guò)程中香草醛會(huì)釋放到葡萄酒中，能加快細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，還可被細(xì)菌代謝成其它化合物，從而提高葡萄酒的香氣[7]。

抑制MLF的因素與殘留農(nóng)藥有關(guān)。有研究認(rèn)為即使數(shù)量很小，殘留農(nóng)藥也能明顯擾亂MLF，甚至?xí)耆种芠8]。對(duì)MLF的抑制作用主要依賴(lài)于所選的蘋(píng)果乳酸細(xì)菌菌株，發(fā)酵葡萄的種類(lèi)，釀造技術(shù)和所用農(nóng)藥類(lèi)型：除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑。

德國(guó)、奧地利、捷克等氣候涼爽的國(guó)家現(xiàn)在開(kāi)始實(shí)施乳酸菌株接種，但仍有大多數(shù)國(guó)家還僅依賴(lài)于未發(fā)酵葡萄酒汁自發(fā)發(fā)酵。對(duì)自發(fā)發(fā)酵的評(píng)估主要是根據(jù)其味道和口感的變化。發(fā)酵過(guò)程缺乏控制會(huì)產(chǎn)生生物胺類(lèi)、多糖、丙烯醛、乙酸、D-乳酸、丁二醇、乙醛或等發(fā)酵副產(chǎn)物。在葡萄酒生物胺中最重要和最經(jīng)常出現(xiàn)的是組胺、酪胺、腐胺、尸胺，其次是苯乙胺、亞精胺、胍基丁胺和色胺。由于釀酒技術(shù)、原材質(zhì)地、可能的污染微生物不同，產(chǎn)生的生物胺質(zhì)量和數(shù)量也會(huì)有所不同。用商業(yè)蘋(píng)果乳酸起始劑來(lái)進(jìn)行葡萄酒接種會(huì)降低合成生物胺的水平。生物胺濃度過(guò)大會(huì)引起腎上腺素釋放、胃酸分泌過(guò)多、心臟泵出力增強(qiáng)、偏頭痛、心動(dòng)過(guò)速、血糖水平升高和高血壓。蘋(píng)果乳酸能產(chǎn)生胺氧化酶來(lái)降低生物胺含量。降解生物胺能力最強(qiáng)的是乳桿菌屬和片球菌屬中的菌株，但很少有人會(huì)注意到這點(diǎn)，因?yàn)樯锇分饕怯蛇@兩類(lèi)菌產(chǎn)生的。選擇合適的釀酒乳酸菌能幫助提高葡萄酒的質(zhì)量和減少生物胺濃度?，F(xiàn)在的葡萄酒工業(yè)主要致力于徹底消除葡萄酒中的生物胺。

除生物胺外，另外一個(gè)副產(chǎn)物是氨基甲酸乙酯，它是由精氨酸脫氨基作用產(chǎn)生的。乙醇與尿素反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為氨基甲酸乙酯。這種化合物被歐盟議會(huì)分類(lèi)為Ⅱ類(lèi)致癌物，緊次于乙烯或丙烯酰胺[9]。因此就需要調(diào)整釀酒工藝來(lái)減少這種物質(zhì)的合成。

3 MLF的啟動(dòng)

蘋(píng)果乳酸發(fā)酵釀造葡萄酒可能會(huì)自發(fā)進(jìn)行，但是此過(guò)程是隨機(jī)的，嚴(yán)重的環(huán)境條件可能會(huì)推遲或完全阻礙MLF的進(jìn)行，因此就需要更加嚴(yán)格的控制此過(guò)程。葡萄酒還可能會(huì)被不良微生物損壞變質(zhì)，例如乙酸菌、乳酸菌屬或接合酵母屬、酒香酵母屬、德克酵母種中的某些菌株。MLF啟動(dòng)時(shí)間受細(xì)菌培養(yǎng)基或酵母代謝產(chǎn)物的影響。理論上，MLF可能會(huì)在四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)啟動(dòng)。

3.1 酒精發(fā)酵之前

只適用于釀制白葡萄酒，用的是植物乳桿菌，此菌對(duì)酒精有很低的耐受度。此過(guò)程消耗糖并產(chǎn)生乳酸和其它二次代謝物，但細(xì)菌壽命很短。還可能會(huì)產(chǎn)生不良物質(zhì)，降低葡萄酒的質(zhì)量和合格率[10]。

3.2 酒精化和MLF同步進(jìn)行

乙醇的強(qiáng)阻礙作用和發(fā)酵液的高酸度，使得有些葡萄酒很難進(jìn)行蘋(píng)果乳酸發(fā)酵。但是有利于乳酸菌生存的環(huán)境也使得葡萄酒易被其它微生物破壞而腐敗。同步酒精化和MLF會(huì)使蘋(píng)果酸更高效的轉(zhuǎn)化為乳酸。升高溫度，降低乙醇濃度和增加葡萄汁營(yíng)養(yǎng)成分有利于酒精發(fā)酵。此外，同步發(fā)酵獲得的葡萄酒可立即進(jìn)行分離，澄清和亞硫酸鹽化，從而提高微生物穩(wěn)定性和收率。

3.3 酒精發(fā)酵完成之前

在酒精發(fā)酵的最后三分之一階段接種酒類(lèi)酒球菌，可以充分利用發(fā)酵產(chǎn)生的熱量，并減小葡萄酒變質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 酒精發(fā)酵之后

有利于蘋(píng)果乳酸菌接種的時(shí)刻是淬火發(fā)酵，這時(shí)殘余糖濃度不超過(guò)4 g/L，而SO2最大總濃度是30 mg/L。雖然此過(guò)程風(fēng)險(xiǎn)最低，但是由于低溫，高SO2濃度，低營(yíng)養(yǎng)物濃度，使得在酒精發(fā)酵之后啟動(dòng)MLF變得更加困難。

4 酵母和細(xì)菌之間的相互作用

4.1 釀酒酵母對(duì)酒類(lèi)酒球菌的抑制作用

酒精主要由酵母合成。其濃度影響細(xì)菌生長(zhǎng)，從而影響MLF。高于8%v/v的酒精能明顯降低細(xì)菌生長(zhǎng)速率，但不影響代謝蘋(píng)果酸的速率。用于轉(zhuǎn)化蘋(píng)果酸的細(xì)菌初始濃度很低。酒精與其他抑制劑聯(lián)合使用可能會(huì)更有效地抑制MLF[11]。

SO2在釀制葡萄酒中非常重要。釀酒酵母產(chǎn)生SO2量的多少取決于所用的菌株。大部分菌株產(chǎn)葡萄酒量少于30 mg/L，有些菌株卻能產(chǎn)生至少100 mg/L的葡萄酒。在酒精濃度為15 mg/L，pH低于3.5時(shí)，游離的SO2能明顯降低細(xì)胞存活率和增殖能力。SO2與其他抑制劑聯(lián)合作用，能限制細(xì)菌生長(zhǎng)，并減弱蘋(píng)果酸發(fā)酵的能力。

酵母產(chǎn)生中鏈脂肪酸，根據(jù)中鏈脂肪酸的濃度和類(lèi)型不同，其抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，減弱蘋(píng)果酸分解代謝能力也有所不同。

胞內(nèi)陽(yáng)離子蛋白也可能會(huì)抑制MLF。在加熱葡萄酒中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MLF抑制作用。由此可以推測(cè)起抑制作用是蛋白質(zhì)，它們?cè)诟邷叵乱鬃冃浴?/p>

酵母對(duì)細(xì)菌的抑制還可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗有關(guān)。缺乏氨基酸不利于MLF細(xì)菌活性。酵母細(xì)胞自溶導(dǎo)致氨基酸不足，從而延遲MLF的啟動(dòng)。增加氨基酸的量，可以啟動(dòng)MLF，但也可能會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的尿素—氨基甲酸乙酯的前體，具有致癌作用，因此必須嚴(yán)格控制它們的量。

4.2 釀酒酵母對(duì)酒類(lèi)酒球菌的刺激作用

酵母不總是抑制蘋(píng)果乳酸細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝活性。背風(fēng)保存條件下酵母細(xì)胞溶解，使得很多氨基酸，多肽等氮類(lèi)化合物釋放到未熟酒中，這些物質(zhì)是細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和獲得相應(yīng)活性所必須的。1000 Da以下的肽類(lèi)能能促進(jìn)酒類(lèi)酒球菌生長(zhǎng)，分子量高于12 KDa的蛋白質(zhì)可能誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁上產(chǎn)生氨肽酶[12]。

甘露糖蛋白是酵母細(xì)胞分泌出來(lái)的另一種化合物。它能吸收中鏈脂肪酸，起到解毒作用；還能刺激細(xì)菌產(chǎn)生水解酶。

4.3 酒類(lèi)酒球菌對(duì)釀酒酵母的抑制作用

蘋(píng)果乳酸菌對(duì)酵母菌抑制作用發(fā)生在酒精發(fā)酵完成前的細(xì)菌接種或誘導(dǎo)MLF自發(fā)進(jìn)行時(shí)。細(xì)菌消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生過(guò)多乙酸，加速了酵母死亡，從而造成葡萄汁中糖不能完全轉(zhuǎn)化。MLF細(xì)菌產(chǎn)生的胞外酶β-1,3葡聚糖酶，能分解酵母細(xì)胞細(xì)胞壁。細(xì)菌還能生物合成BLIS，并且明顯的控制微生物區(qū)系和最終產(chǎn)品中微生物的穩(wěn)定性。

5 結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用不同的接種方案和釀酒工藝可能使未發(fā)酵葡萄汁更好地轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量葡萄酒，然而釀制能否成功主要依賴(lài)于選擇合適的酵母—細(xì)菌組合。

[1]Kenny G J,Harrison P A.The effects of climate variability and change on grape suitability in Europe[J].J Wine Res,3:163-183.

[2]Versari A,Parpinello G P,Cattaneo M.Leuconostoc oenos and malolactic Fermentation in wine:a review[J].J Ind Microbiol Biotechnol,1999，23（6）:447-455.

[3]Yurdugul S,Bozoglu F.Studies on an inhibitor produced by lactic acid bacteria of wines on the control of malolactic fermentation[J].Eur Food Res Technol,2002,215(1):38-41.

[4]Davis C R,Wibowo D,Eschenbruch R.Practical implications of malolactic fermentation in wine[J].J Appl Bacteriol,63:513-521.

[5]Cabrita M J,Torres M,Palma V.Impact of malolactic fermentation on low molecular weight phenolic compounds[J].Talanta,2008，74（5）:1281-1286.

[6]MORENO-ARRIBAS M V.Evolution of red wine anthocyanins during malolactic fermentation,postfermentative treatment and ageing with lees[J].Food Chem,2008，109（（1）:149-158.

[7]DE REVEL G,BLOEM A,AUGUSTIN M.Interaction of Oenococcus oeni and oak wood compounds[J].Food Microbiol,2005，22（6）:569-575.

[8]VIDAL M T,POBLET M,BORDONS A.Inhibitory effect of copper and dichlofluanid on Oenococcus oeni and malolactic fermentation[J].Am J Enol Vitic,2001,52（3）:223-229.

[9]UTHURRY C A,SUAREZ LEPE J A.Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine[J].Food Chem,2006，94（2）:262-270.

[10]KNOLL C,FRITSCH S.Impact of different malolactic fermentation inoculation scenarios on Riesling wine aroma[J].World J Microbiol Biotechnol,2012，28（3）:1143-1153.

[11]NEHME N,MATHIEU F.Quantitative study of interactions between Saccharomyces cerevisiae and Oenococcus oeni strains[J].J Microbiol Biotechnol,2008，35（7）:685-693.

[12]DE NARDA M C M,FARIAS M E,POLO M C.Proteolytic effect of Oenococcus oeni on the nitrogenous macromolecular fraction of red wine[J].FEMS Microbiol Lett,1999,174（1）:41-47.