王瓊，王遠(yuǎn)山

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310000）

1 前言

稀有糖是常見單糖（如半乳糖、葡萄糖等）分子中至少一個羥基被氫原子或其他基團所取代而形成的化合物[1]。據(jù)推測，在自然界中約有50種稀有糖，至今已發(fā)現(xiàn)34種，D-型稀有糖與L-型稀有糖各占一半[2]。其中D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-阿洛糖、L-系列糖和木糖醇等稀有糖具有及其良好的理化性質(zhì)及活性功能（表1），廣泛應(yīng)用于甜味劑、醫(yī)藥中間體和保健食品體的生產(chǎn)等領(lǐng)域[2]。目前稀有糖的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。化學(xué)合成法涉及到催化加氫、加成反應(yīng)、Ferrier重排等反應(yīng)，其中關(guān)環(huán)轉(zhuǎn)換合成法和兩步合成法是具有一定競爭力的方法。但這些方法反應(yīng)存在著反應(yīng)步驟多、需保護和脫保護、條件苛刻、產(chǎn)率較低和副產(chǎn)物多等不足，還需要改進和完善。近年來，以差向異構(gòu)酶為基礎(chǔ)的稀有糖生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)由于其良好的立體選擇性、溫和的反應(yīng)條件等優(yōu)點而日益受到重視[1-2]。

差向異構(gòu)酶，又稱變旋酶，是催化單糖分子中某一個不對稱碳原子的構(gòu)型變化的酶。目前報道的可應(yīng)用于稀有糖大規(guī)模生產(chǎn)的差向異構(gòu)酶，僅有 D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶 （D-tagatose 3-epimerase，DTEase）和D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶（D-psicose 3-epimerase，DPEase）。

近年來，利用廉價單糖為原料，通過差向異構(gòu)酶實現(xiàn)己酮糖C-3位置間的差向異構(gòu)反應(yīng)制備稀有糖，已成為生化工程領(lǐng)域中的研究熱點。本文主要介紹了DTE酶家族成員DTEase和DPEase的來源、酶學(xué)特性、蛋白結(jié)構(gòu)以及DTE酶家族在稀有糖生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀等，最后展望了DTE酶家族未來的發(fā)展方向。

表1 常見稀有糖及其生物學(xué)功能

2 DTE酶家族

2.1 DTE酶家族成員的來源

二十世紀(jì)九十年代，日本Izumori團隊首次報道了來源于菊芋假單胞菌 （Pseudomonas cichorii ST-24）中的一種酶可催化D-山梨糖（D-sorbose）和D-塔格糖之間的差向異構(gòu)反應(yīng)[6]，因其最適底物為塔格糖，將其命名為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶（DTEase）。2006年，韓國Oh團隊成功克隆表達(dá)了根癌農(nóng)桿菌 （Agrobacterium tumefaciens）中的DTEase基因，由于該酶對D-阿洛酮糖有較強的底物特異性，后將其更名為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶[7]（DPEase）。 DTEase和 DPEase可催化相似系列的反應(yīng)，即單糖C-3位置的差向異構(gòu)反應(yīng)，因此共同構(gòu)成了一個新家族—DTE酶家族。至今為止，已先后在類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides SK011）[8]、 梭狀芽胞桿菌（Clostridium cellulolyticum H10）[9]、瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）[10]和 Desmospora sp.[11]中發(fā)現(xiàn)了新的 DTE 酶家族成員，如表2所示。

2.2 DTE酶家族的酶學(xué)特性

DTEase和DPEase雖催化相同系列的反應(yīng)，但因來源不同，兩者的最適pH、最適溫度、半衰期、底物特異性等生化特性存在較大差異，表3列出了不同DTE酶家族成員的生化特性。據(jù)表3可知，DTE家族酶適宜中性或弱堿性環(huán)境；與其它來源的DTEase相比，R.sphaeroides的DTEase耐熱性最差；而C.cellulolyticum中的DPEase半衰期明顯比其他來源的DPEase的半衰期長，具有更好的穩(wěn)定性；A.tumefaciens的DPEase的米氏常數(shù)Km值最小，對D-果糖的親和力最強；在D-果糖與D-阿洛酮糖的差向異構(gòu)反應(yīng)中6種酶表現(xiàn)出不同的平衡比，具體見表3所示。

表2 DTE酶家族成員的來源

2.3DTEase和DPEase的結(jié)構(gòu)

為闡明DTE酶家族的催化機制，Kim和Yoshida先后利用X射線衍射技術(shù)解析了DPEase和DTEase的蛋白晶體結(jié)構(gòu)[14-15]。

表3 DTE家族酶的酶學(xué)特性

2.3.1 A.tumefaciens DPEase晶體結(jié)構(gòu)

圖1 DPEase的分子結(jié)構(gòu)

Kim[14]對DPEase蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析表明，A.tumefaciens DPEase是由A、B、C和D 4個相同的亞基構(gòu)成的四聚體分子，見圖1(a)。圖1(a)標(biāo)出的2個黑點為推測的金屬離子結(jié)合位點。每個亞基包含8個β折疊和12個α螺旋，而8個β折疊簇被12個α螺旋緊緊環(huán)繞，整體呈TIM-桶結(jié)構(gòu)，見圖1(b)。該酶為金屬離子依賴型酶，金屬離子與 Glu150、Asp183、His209 和 Glu244 結(jié)合構(gòu)成活性中心，進行酶催化反應(yīng)。Zhang等[17]報道Desmospora sp.的DPEase添加Co2+后熱穩(wěn)定性顯著提高。

圖2 DTEase（a）與 DPEase（b）的分子結(jié)構(gòu)

圖3 DTEase的分子結(jié)構(gòu)：（a）二聚體結(jié)構(gòu)（b）單體結(jié)構(gòu)

2.3.2 P.cichorii DTEase晶體結(jié)構(gòu)

Yoshida[15]對 P.cichorii DTEase蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析表明，該酶與A.tumefaciens DPEase的晶體結(jié)構(gòu)相似，由Mol-A、Mol-B、Mol-C和 Mol-D組成（圖2）。圖3（a）顯示兩個對稱的Mol-A和Mol-B亞基構(gòu)成的二聚體分子。每個亞基包含11個α螺旋和8個β折疊，整體呈現(xiàn)(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，如圖 3（b）所示。

3 DTE酶家族在稀有糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

2006年，Izumori團隊報道了利用DTE家族酶催化8種己酮糖C-3位置的差向異構(gòu)反應(yīng)[16]。圖4列出了利用DTEase在D-果糖與D-阿洛酮糖、D-塔格糖與D-山梨糖、L-果糖與L-阿洛酮糖、L-塔格糖與L-山梨糖之間的差向異構(gòu)反應(yīng)。除了D-果糖，其余7種己酮糖均為稀有糖[2]。

圖4 DTEase催化己酮糖間的差向異構(gòu)化反應(yīng)

隨后，Izumori等[16]又提出了利用D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶、醛糖異構(gòu)酶、醛糖還原酶、氧化還原酶（polyol dehydrogenase，PDH）制備各種稀有糖的Izumoring方法（圖5），使得稀有糖的相互轉(zhuǎn)化形成了一個循環(huán)網(wǎng)絡(luò)，對稀有糖的生產(chǎn)具有極其重要的意義。

圖5 丁糖、戊糖和己糖類稀有糖的生物酶法轉(zhuǎn)化

3.1 DTE酶家族在D-阿洛酮糖制備中的應(yīng)用進展

目前，催化D-果糖制備D-阿洛酮糖所利用的酶主要是DTE酶家族的DPEase和DTEase。

2008年，Kim等[17]發(fā)現(xiàn)利用DTEase轉(zhuǎn)化果糖制備阿洛酮糖的過程中，添加適量的硼酸鹽可以改變原有的化學(xué)平衡。因硼酸鹽與阿洛酮糖的親和作用較強，促使反應(yīng)平衡沿著產(chǎn)物阿洛酮糖方向轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)64%，相比不添加硼酸鹽轉(zhuǎn)化率提高了近兩倍。2009年，Lim等[18]通過固定化含有硼酸鹽的A.tumefaciens DPEase大規(guī)模生產(chǎn)D-阿洛酮糖，該固定化酶催化700 g/L的D-果糖時，D-阿洛酮糖的產(chǎn)量可達(dá)441 g/L。2011年，Mu等[19]報道了利用在大腸桿菌中過量表達(dá)的梭狀芽胞桿菌DPEase催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖，最終產(chǎn)量可達(dá)218 g/L。2013年，Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)來源于DTE酶家族新成員Desmospora sp.8437中的DPEase與Co2+離子結(jié)合后表現(xiàn)出最高酶活，催化500 g/L的D-果糖時D-阿洛酮糖產(chǎn)量達(dá)142.5 g/L。目前文獻(xiàn)報道的DTE酶家族催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的催化反應(yīng)多在堿性緩沖液中進行，但是在該條件下會產(chǎn)生褐變，同時導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)生[12]。2014年，Jia等[12]報道了利用異源表達(dá)的C.bolteae DPEase在中性緩沖液條件下制備D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.8%。

3.2 DTE酶家族在稀有支鏈單糖制備中的應(yīng)用

隨著研究的深入開展，研究人員發(fā)現(xiàn)DTE酶家族是一種底物譜相對廣泛的酶，可以催化稀有支鏈單糖的差向異構(gòu)反應(yīng)。

Rao等[20]報道了利用DTEase催化4-甲基-L-核酮糖（4-C-methyl-L-ribulose）與 4-甲基-L-木酮糖（4-C-methyl-L-xylulose）、4-甲基-D-核酮糖（4-C-methyl-D-ribulose）與 4-甲基-D-木酮糖之間（4-C-methyl-D-xylulose）之間的差向異構(gòu)化反應(yīng)，見圖6。

圖6 DTEase催化4-C-甲基-戊糖的差向異構(gòu)反應(yīng)

4 展望

自從Izumori團隊首次發(fā)現(xiàn)DTEase并借助Izumoring策略成功地實現(xiàn)所有稀有糖的相互轉(zhuǎn)化以來，利用差向異構(gòu)酶制備各種功能性稀有糖就成為研究熱點，研究集中在新的產(chǎn)酶菌株的篩選、催化機理、酶分離純化、酶固定化等方面。目前已取得了一定進展，為阿洛酮糖等功能性稀有糖的生產(chǎn)提供了一條具有原子經(jīng)濟性和更綠色的途徑。

為促進差向異構(gòu)酶法生產(chǎn)功能性稀有糖的研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，目前仍需在以下方面需加大研究力度：（1）DTE酶家族成員資源的拓展，目前僅有來源于6種菌株中的DTEase和DPEase被確定為DTE家族成員，在底物譜等方面存在著差異。因此，獲得新的DTE家族酶將為酶法制備稀有糖的研究提供基礎(chǔ)。（2）差向異構(gòu)酶催化機理的研究，目前對其催化機理研究還處于初步的階段，對酶的結(jié)構(gòu)與催化功能、立體選擇性的關(guān)系等尚待深化；（3）差向異構(gòu)酶催化性能提升，現(xiàn)有的酶的熱穩(wěn)定性、底物特異性等還存在著一些不足，可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對其進行分子改造以提高催化性能、拓寬底物譜；（4）差向異構(gòu)酶應(yīng)用范圍的擴大，要進一步利用其底物特異性，嘗試DTE家族在新型的支鏈稀有糖生產(chǎn)中的應(yīng)用，以實現(xiàn)功能性稀有糖的高效和綠色生產(chǎn)。

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