孫炳奇* 張 娟孫 嬌張 婷

（1 沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110044；2 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361102）

探針熔解曲線技術(shù)檢測結(jié)核桿菌耐藥的研究

孫炳奇1* 張 娟1孫 嬌1張 婷2

（1 沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110044；2 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361102）

目的評價(jià)探針熔解曲線技術(shù)檢測結(jié)核桿菌耐藥效果。方法利用探針熔解曲線技術(shù)對46例涂陽肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行異煙肼和利福平耐藥檢測，以傳統(tǒng)羅氏藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，對探針熔解曲線技術(shù)的檢測效果進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果在46例菌株中，用探針熔解曲線進(jìn)行異煙肼耐藥基因檢測，與羅氏藥敏的符合率為91.3%，進(jìn)行利福平耐藥基因檢測，符合率為84.8%。結(jié)論探針熔解曲線檢測異煙肼和利福平的耐藥性與羅氏藥敏方法具有很好的一致性，具有簡便快速，靈敏度高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)，對臨床及時(shí)準(zhǔn)確進(jìn)行抗結(jié)核治療具有重要意義。

探針熔解曲線；異煙肼；利福平；耐藥

本研究采用探針熔解曲線技術(shù)分別檢測異煙肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampicin，RFP）的耐藥情況，并與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)進(jìn)行對比，探討其在藥敏檢測中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本與試劑

選取羅氏培養(yǎng)生長陽性菌株46例，包括11例INH和RPF均敏感菌株，21例耐多藥菌株，5例單耐INH和9例單耐RFP菌株。Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀（美國伯樂），結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）和結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）均為廈門致善生物科技有限公司產(chǎn)品[1]。

1.2 羅氏藥敏試驗(yàn)

通過觀察改良羅氏培養(yǎng)基上結(jié)核分枝桿菌菌落的生長速度、色澤等生物學(xué)性狀，選取適當(dāng)?shù)木?，按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]，挑取培養(yǎng)基上菌落，用無菌0.5% TWEEN80生理鹽水溶解、稀釋。與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔粗瞥? mg/mL菌懸液，10倍稀釋至10-2mg/mL，用滅菌吸管準(zhǔn)確吸取0.1 mL菌液分別接種至對照及含藥培養(yǎng)基斜面，每管接種量為10-3mg。異煙肼和利福平藥物濃度分低高兩種濃度，分別是0.2、1 μg/mL；50、250 μg/mL。

1.3 樣本制備及核酸提取

取羅氏培養(yǎng)基上生長的結(jié)核分枝桿菌，用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)收集細(xì)菌1環(huán)，并懸在250 μL結(jié)核桿菌DNA提取液中。封口膜封口，99 ℃加熱20 min，14000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管，上清即為DNA模板。

1.4 探針熔解曲線技術(shù)檢測樣本

取DNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，利福平組反應(yīng)參數(shù)為UNG 處理50 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s（每個(gè)循環(huán)下降1 ℃），76 ℃ 25 s，13個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25 s，42個(gè)循環(huán)。熔解分析程序：95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，45～85 ℃（設(shè)置在此階段每1 ℃采集FAM和TET通道熒光信號(hào)），1個(gè)循環(huán)。

異煙肼組反應(yīng)參數(shù)為UNG 處理50 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，71 ℃ 25 s（每個(gè)循環(huán)下降1 ℃），75 ℃30 s，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，61 ℃ 25 s，75 ℃ 25 s，45個(gè)循環(huán)。熔解分析程序：95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，40～80 ℃（設(shè)置在此階段每1 ℃采集FAM和TET通道熒光信號(hào)），1個(gè)循環(huán)。

1.5 與羅氏藥敏結(jié)果不符的標(biāo)本均進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序引物分別為INH-ahpC-seq-F：5'-CTTGCCGGAAAGACATGCC-3'，INH-ahpC-seq-R:5'-CGTCA CTGGTGATAGTGGTGA-3'；INH-inhA-seq-F：5'-AGCGCGACATACCTGCTG-3'，INH-inhA-seq-R：5'-CCGATCCCCCGGTTTCC-3'；INH-inhA94-seq-F：5'-CGTTTC ACATCGCACGGG-3'，INH-inhA94-seq-R：5'-GGCTCGGGTCGAAGTCC-3'；INH-katG-seq-F：5'-CGAGACGTTTCGGCGC-3'，INH-katG-seq-R：5'-CCGTCCTT GGCGGTGT-3'；RFP-seq-F：5'-CGGGAGCGGATGACCAC-3'，RFP-seq-R：5'-GCG GTACGGCGTTTCGAT-3'。測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以絕對濃度法檢測結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算高分辨率探針熔解曲線法的敏感度和特異度，兩種方法檢測結(jié)果的差異性卡方檢驗(yàn)判別，兩種方法檢測結(jié)果的一致性用Kappa檢驗(yàn)判別。

2 結(jié) 果

2.1 探針熔解曲線技術(shù)藥物敏感性的檢測結(jié)果

對INH檢測的46例菌株中，探針熔解曲線技術(shù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果與羅氏藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＞0.05）。耐藥42例與羅氏藥敏結(jié)果相符，總符合率為91.3%，Kappa值為0.825，敏感度和特異度分別是88.5%和95.0%；46例對RFP檢測結(jié)果中，探針熔解曲線技術(shù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果與羅氏藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＞0.05）。39例與羅氏結(jié)果相符，總符合率為84.8%，Kappa值為0.680，敏感度和特異度分別是80.0%和93.8%，見表1和表2。

表1 探針熔解曲線對異煙肼和利福平藥物敏感性檢測結(jié)果

表2 探針熔解曲線技術(shù)檢測耐藥的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Kappa值

2.2 探針熔解曲線法與測序結(jié)果

對INH檢測的46例菌株中，4例與結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”羅氏藥敏結(jié)果不相符。基因檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”為測序法，將該4例樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。2例樣本的羅氏藥敏結(jié)果為耐藥，探針熔解曲線結(jié)果為敏感，測序結(jié)果為野生型。1例樣本的羅氏藥敏結(jié)果為敏感，探針熔解曲線結(jié)果為耐藥，測序結(jié)果為katG 315AGC＞GGC。1例樣本的羅氏藥敏結(jié)果為耐藥（高濃度耐藥），探針熔解曲線為敏感，測序結(jié)果為野生型與ahpC啟動(dòng)子區(qū)-10C＞T混合，即不均一耐藥樣本導(dǎo)致探針熔解曲線結(jié)果判讀失誤。ahpC啟動(dòng)子區(qū)-10 C＞T的不均一耐藥相對不易判讀，需要依據(jù)經(jīng)驗(yàn)結(jié)合峰型進(jìn)行判讀。

對RFP檢測的46例菌株中，7例與結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”羅氏藥敏結(jié)果不相符?；驒z測的“金標(biāo)準(zhǔn)”為測序法，將該7例樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。6例樣本的羅氏藥敏結(jié)果為耐藥，探針熔解曲線結(jié)果為敏感，測序結(jié)果為野生型。1例樣本的羅氏藥敏結(jié)果為敏感，探針熔解曲線結(jié)果為耐藥，測序結(jié)果為rpoB 531 TCGTTG。

測序結(jié)果與探針熔解曲線的結(jié)果相比，除1份不均一耐藥樣本探針熔解曲線未成功判讀外，結(jié)果均一致。

3 討 論

近年來，結(jié)核分枝桿菌耐藥性呈逐年上升趨勢，異煙肼和利福平作為抗結(jié)核一線藥物，其耐藥性檢測對于臨床結(jié)核病藥物治療具有重要意義。本研究將其用于異煙肼和利福平耐藥檢測，結(jié)果顯示與羅氏培養(yǎng)結(jié)果的符合率分別為91.3%和84.8%，敏感度為88.5%和80.0%，特異度為95.0%和93.8%，陽性預(yù)測值為95.8%和96.0%，Kappa值為0.825

和0.680（Kappa值＞0.81一般表示二者之間具有非常好的一致性，0.61～0.81之間則認(rèn)為有較好的一致性，＜0.4則代表兩試驗(yàn)方法間一致性較差）。與羅氏藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致樣本經(jīng)測序后證明，除1份不均一耐藥樣本探針熔解曲線未成功判讀外，其余樣本的探針熔解曲線結(jié)果與測序結(jié)果均完全一致。與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，探針熔解曲線檢測技術(shù)在應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥的快速檢測時(shí)有較高的陽性檢出能力，有著良好的特異度和靈敏度，同時(shí)更加簡便、快速。

[1] 中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[M].北京:中國教育文化出版社,2006:56-57.

[2] 張立群,王云霞,周敏,等.4種不同結(jié)核分枝桿菌檢測方法對結(jié)核病的診斷價(jià)值比較[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2010,20(11):1633-1635.

R521

B

1671-8194（2014）13-0076-02

沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（F12-255-1-00）

*通訊作者：E-mail:sunbq2004@163.com