孔雯雯　張明森　林秀菁等

[摘要] 目的 建立定量檢測注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）中內(nèi)毒素的質(zhì)控方法。 方法 采用動態(tài)顯色法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗證和干擾試驗，建立檢測rhGM-CSF中內(nèi)毒素的定量方法。 結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗證中，曲線的R2均>0.98，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立；干擾試驗顯示，供試品復(fù)溶后稀釋5倍后加入0.5 EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素作為供試品回收液，經(jīng)檢測其內(nèi)毒素回收率均接近100%，該稀釋倍數(shù)下，供試品濃度對內(nèi)毒素實驗的干擾作用較??；另外，日常檢測2批供試品的內(nèi)毒素含量均小于限值，與凝膠法檢測結(jié)果一致。 結(jié)論 該動態(tài)顯色法方法可用于rhGM-CSF中內(nèi)毒素的定量檢測。

[關(guān)鍵詞] 動態(tài)顯色法；注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；內(nèi)毒素；定量

[中圖分類號] R927.12 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）03（a）-0012-03

細(xì)菌內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性致熱原[1]，它是G-菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，能夠在有機(jī)體內(nèi)作用于單核巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、前列腺素、凝血素及干擾素等多種細(xì)胞因子，這些因子過量時可引起機(jī)體發(fā)熱、心動過速，甚至休克[2]。因此，為了保證注射劑藥品的安全使用，各國藥典均將熱原檢測列為重要檢查項目，熱原控制也成為藥品生產(chǎn)質(zhì)控的重要對象之一[3-4]。

Levin和Bang于1968年發(fā)現(xiàn)并建立了鱟試劑法進(jìn)行體外檢測細(xì)菌內(nèi)毒素[5]，該法簡便快速、靈敏度高及重現(xiàn)性好的優(yōu)點使其迅速成為熱原檢測中家兔法的替代方法[6]。目前所使用的鱟試劑法多為凝膠限值法，《中國藥典》對注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查也采用該法。凝膠法是目前最常用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，但其是一種半定量測定方法，無法給出準(zhǔn)確的含量。因此，為了更好滿足藥品檢查和生產(chǎn)過程質(zhì)控的嚴(yán)格要求，內(nèi)毒素檢測已逐漸向定量方向發(fā)展，其中，動態(tài)顯色法是目前靈敏度最高和檢測范圍最寬的定量測定法，該法是通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物中對硝基苯氨到達(dá)某一預(yù)設(shè)吸光度所需要的反應(yīng)時間來檢測樣品中的內(nèi)毒素含量[7]。因此，動態(tài)顯色法已被各國藥典逐漸推廣并應(yīng)用于藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測[8]。國內(nèi)目前采用動態(tài)顯色法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測的報道尚不多見，本研究參照《中國藥典》2010年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗[9]，并將結(jié)果與凝膠法進(jìn)行比較，探討并研究動態(tài)顯色法定量檢測rhGM-CSF中細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

XW-80A型漩渦混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司）；Spectra Max 340PC384型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices）。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，批號：1205040；規(guī)格：10 EU/支，湛江安度斯生物有限公司）；動態(tài)顯色法鱟試劑（KCA，批號：1203020；規(guī)格：1.25 ml/支，靈敏度0.005 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（TAL，批號：110604；規(guī)格：0.1 ml/支，靈敏度0.5 EU/ml，廈門鱟試劑廠）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號：1211120；規(guī)格：5 ml，湛江安度斯生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

《中國藥典》規(guī)定rhGM-CSF原液中內(nèi)毒素的限值為10 EU/300 μg，成品中內(nèi)毒素限值為10 EU/支。公司內(nèi)部將安全系數(shù)提高10倍，成品中限值確立為L=1 EU/支。試驗中rhGM-CSF成品規(guī)格為100 μg/瓶，則限值可表示為10 EU/mg。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗證

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，加入1 ml BET水復(fù)溶為10 EU/ml的儲備液。將10 EU/ml標(biāo)準(zhǔn)品用BET水稀釋為5、0.5、0.05、0.005 EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液。取無熱原微孔板，每孔加入100 μl的BET水（陰性對照）和各濃度標(biāo)準(zhǔn)液，均平行3孔。再加入100 μl的動態(tài)顯色鱟試劑并混勻，放入酶標(biāo)儀中于37℃孵育60 min，每隔1 min 檢測樣品在405 nm的吸光度（OD）。

1.2.3 干擾試驗

①供試品最大稀釋倍數(shù)（MVD）計算：rhGM-CSF成品規(guī)格為100 μg/瓶，復(fù)容后體積為1 ml，即濃度為0.1 mg/ml，限值為10 EU/mg。根據(jù)MVD=cL/λ，c為供試品濃度，L為限值，λ為鱟試劑的靈敏度0.005 EU/ml，則MVD=200（倍）。②預(yù)實驗：制備終濃度為5、0.5、0.05、0.005 EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，將rhGM-CSF（批號：20120101）用BET水依次稀釋成20、10、5、2倍4個梯度，作為供試品溶液（A液）。選擇0.5 EU/ml作為靠近曲線中點的內(nèi)毒素濃度（λm），將供試品稀釋液按近似法（9∶1）加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，作為供試品回收溶液（B液）。標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰性對照、供試品和供試品回收溶液均做2個平行，置酶標(biāo)儀中孵育并檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)菌內(nèi)毒素的含量和回收率。③正式實驗：根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，另取3批樣品（批號：20120701、20120702、20120802），分別制備一定濃度的A液和B液，依法檢查。

1.2.4 樣品的日常檢查

1.2.4.1 動態(tài)顯色法 取2批rhGM-CSF成品（批號：20120901、20130201），供試品檢查同“1.2.3”項的方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的內(nèi)毒素含量。

1.2.4.2 凝膠法 取10 EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)品一支，稀釋至1 EU/ml作為陽性對照。取2批供試品各1支（批號：20120901、20130201），加入1 ml BET水復(fù)溶作為待檢品。參照《中國藥典》的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法操作，于鱟試劑中加入陰性、陽性對照、供試品陽性對照和供試品溶液，各做2個平行。37℃孵育1 h后，取出試管緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)凝膠不變形、不脫落則為陽性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗證

預(yù)設(shè)OD=0.02，以反應(yīng)時間的對數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對數(shù)（lgc）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程：lgT=-0.2793lgc+2.6775，R2=0.996，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較好，且陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度0.005 EU/ml的反應(yīng)時間，各平行孔的RSD均<10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立（表1）。

2.2 干擾試驗

2.2.1 預(yù)實驗

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算A液和B液中的內(nèi)毒素的含量及回收率（表2）。結(jié)果顯示，供試品回收液B20、B10、B5、B2的回收率分別為74.74%、75.68%、106.62%、79.70%，均在50%～200%，對檢測結(jié)果干擾較小。而稀釋5倍時其回收率更接近100%，因此采用5倍的稀釋液（0.02 mg/ml）進(jìn)一步檢驗。

2.3.2 正式實驗

經(jīng)檢測，3批樣品B液的回收率均在50%～200%，符合要求（表2）。因此，在5倍的稀釋條件下，供試品對內(nèi)毒素實驗的干擾作用較小，可用作該品種日常檢查的稀釋倍數(shù)。

2.4 樣品的日常檢查

2.4.1 動態(tài)顯色法

結(jié)果顯示，2批樣品中內(nèi)毒素含量分別為0.0087、0.0096 EU/ml（表3），復(fù)容后體積為1 ml，樣品濃度為0.1 mg/ml，內(nèi)毒素含量即為0.087、0.096 EU/mg，均小于限值10 EU/mg。

2.4.2 凝膠法

凝膠法檢測樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的結(jié)果見表4，其中陽性和供試品陽性對照均呈現(xiàn)凝膠，陰性對照及供試品未有凝膠產(chǎn)生。因此，2批供試品中內(nèi)毒素含量均<1 EU/ml，即10 EU/mg，符合規(guī)定。

3 討論

本研究采用動態(tài)顯色法對rhGM-CSF成品中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，對樣品進(jìn)行5倍稀釋時其回收率在100%左右，樣品對檢測結(jié)果的干擾作用較小，2批樣品稀釋5倍后檢查結(jié)果均小于限值。另外，在實驗中采取凝膠法和動態(tài)顯色法在相同實驗條件下進(jìn)行測定，兩種實驗方法得到一致的結(jié)果，符合《中國藥典》對細(xì)菌內(nèi)毒素實驗成立的規(guī)定。因此，用動態(tài)顯色法檢測rhGM-CSF成品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法是可行的。

應(yīng)用動態(tài)顯色法檢測rhGM-CSF成品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便等優(yōu)點，能很好地滿足質(zhì)控的要求，為完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 于婷，蔡彤，張國來，等.細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品原料的制備及其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的分析[J].中國藥學(xué)雜志，2010，45（5）：388-391.

[2] 郭萌，李冠民，黃清泉.細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展[J].中國實驗動物學(xué)報，2009，17（5）：397-401.

[3] 陽怡，白兆平.各國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的比較[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2001，9（1）：41-42.

[4] 周飛.注射劑生產(chǎn)中熱原控制的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（28）：71-72.

[5] Levin J，Bang FB.Clottable protein in Limulus：its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin[J].Thromb Diath Haemorrh，1968，19（1）：186-197.

[6] 邱娟，盛振斌.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用進(jìn)展[J].臨床合理用藥，2011，4（3C）：128-129.

[7] 秦媛媛，吳彥霖，劉倩，等.三類體外熱原檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國藥事，2012，26（5）：507-512.

[8] 張永堅，馮聚錦.鱟試劑在藥品生產(chǎn)過程細(xì)菌內(nèi)毒素控制上的應(yīng)用[J].醫(yī)藥工程設(shè)計雜志，2003，24（1）：11-14.

[9] 國家藥典委員會.中國藥典（三部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95-98.

（收稿日期：2013-09-06 本文編輯：林利利）

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗證

預(yù)設(shè)OD=0.02，以反應(yīng)時間的對數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對數(shù)（lgc）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程：lgT=-0.2793lgc+2.6775，R2=0.996，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較好，且陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度0.005 EU/ml的反應(yīng)時間，各平行孔的RSD均<10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立（表1）。

2.2 干擾試驗

2.2.1 預(yù)實驗

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算A液和B液中的內(nèi)毒素的含量及回收率（表2）。結(jié)果顯示，供試品回收液B20、B10、B5、B2的回收率分別為74.74%、75.68%、106.62%、79.70%，均在50%～200%，對檢測結(jié)果干擾較小。而稀釋5倍時其回收率更接近100%，因此采用5倍的稀釋液（0.02 mg/ml）進(jìn)一步檢驗。

2.3.2 正式實驗

經(jīng)檢測，3批樣品B液的回收率均在50%～200%，符合要求（表2）。因此，在5倍的稀釋條件下，供試品對內(nèi)毒素實驗的干擾作用較小，可用作該品種日常檢查的稀釋倍數(shù)。

2.4 樣品的日常檢查

2.4.1 動態(tài)顯色法

結(jié)果顯示，2批樣品中內(nèi)毒素含量分別為0.0087、0.0096 EU/ml（表3），復(fù)容后體積為1 ml，樣品濃度為0.1 mg/ml，內(nèi)毒素含量即為0.087、0.096 EU/mg，均小于限值10 EU/mg。

2.4.2 凝膠法

凝膠法檢測樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的結(jié)果見表4，其中陽性和供試品陽性對照均呈現(xiàn)凝膠，陰性對照及供試品未有凝膠產(chǎn)生。因此，2批供試品中內(nèi)毒素含量均<1 EU/ml，即10 EU/mg，符合規(guī)定。

3 討論

本研究采用動態(tài)顯色法對rhGM-CSF成品中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，對樣品進(jìn)行5倍稀釋時其回收率在100%左右，樣品對檢測結(jié)果的干擾作用較小，2批樣品稀釋5倍后檢查結(jié)果均小于限值。另外，在實驗中采取凝膠法和動態(tài)顯色法在相同實驗條件下進(jìn)行測定，兩種實驗方法得到一致的結(jié)果，符合《中國藥典》對細(xì)菌內(nèi)毒素實驗成立的規(guī)定。因此，用動態(tài)顯色法檢測rhGM-CSF成品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法是可行的。

應(yīng)用動態(tài)顯色法檢測rhGM-CSF成品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便等優(yōu)點，能很好地滿足質(zhì)控的要求，為完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

[參考文獻(xiàn)]

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[2] 郭萌，李冠民，黃清泉.細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展[J].中國實驗動物學(xué)報，2009，17（5）：397-401.

[3] 陽怡，白兆平.各國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的比較[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2001，9（1）：41-42.

[4] 周飛.注射劑生產(chǎn)中熱原控制的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（28）：71-72.

[5] Levin J，Bang FB.Clottable protein in Limulus：its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin[J].Thromb Diath Haemorrh，1968，19（1）：186-197.

[6] 邱娟，盛振斌.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用進(jìn)展[J].臨床合理用藥，2011，4（3C）：128-129.

[7] 秦媛媛，吳彥霖，劉倩，等.三類體外熱原檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國藥事，2012，26（5）：507-512.

[8] 張永堅，馮聚錦.鱟試劑在藥品生產(chǎn)過程細(xì)菌內(nèi)毒素控制上的應(yīng)用[J].醫(yī)藥工程設(shè)計雜志，2003，24（1）：11-14.

[9] 國家藥典委員會.中國藥典（三部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95-98.

（收稿日期：2013-09-06 本文編輯：林利利）

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗證

預(yù)設(shè)OD=0.02，以反應(yīng)時間的對數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對數(shù)（lgc）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程：lgT=-0.2793lgc+2.6775，R2=0.996，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較好，且陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度0.005 EU/ml的反應(yīng)時間，各平行孔的RSD均<10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立（表1）。

2.2 干擾試驗

2.2.1 預(yù)實驗

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算A液和B液中的內(nèi)毒素的含量及回收率（表2）。結(jié)果顯示，供試品回收液B20、B10、B5、B2的回收率分別為74.74%、75.68%、106.62%、79.70%，均在50%～200%，對檢測結(jié)果干擾較小。而稀釋5倍時其回收率更接近100%，因此采用5倍的稀釋液（0.02 mg/ml）進(jìn)一步檢驗。

2.3.2 正式實驗

經(jīng)檢測，3批樣品B液的回收率均在50%～200%，符合要求（表2）。因此，在5倍的稀釋條件下，供試品對內(nèi)毒素實驗的干擾作用較小，可用作該品種日常檢查的稀釋倍數(shù)。

2.4 樣品的日常檢查

2.4.1 動態(tài)顯色法

結(jié)果顯示，2批樣品中內(nèi)毒素含量分別為0.0087、0.0096 EU/ml（表3），復(fù)容后體積為1 ml，樣品濃度為0.1 mg/ml，內(nèi)毒素含量即為0.087、0.096 EU/mg，均小于限值10 EU/mg。

2.4.2 凝膠法

凝膠法檢測樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的結(jié)果見表4，其中陽性和供試品陽性對照均呈現(xiàn)凝膠，陰性對照及供試品未有凝膠產(chǎn)生。因此，2批供試品中內(nèi)毒素含量均<1 EU/ml，即10 EU/mg，符合規(guī)定。

3 討論

本研究采用動態(tài)顯色法對rhGM-CSF成品中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，對樣品進(jìn)行5倍稀釋時其回收率在100%左右，樣品對檢測結(jié)果的干擾作用較小，2批樣品稀釋5倍后檢查結(jié)果均小于限值。另外，在實驗中采取凝膠法和動態(tài)顯色法在相同實驗條件下進(jìn)行測定，兩種實驗方法得到一致的結(jié)果，符合《中國藥典》對細(xì)菌內(nèi)毒素實驗成立的規(guī)定。因此，用動態(tài)顯色法檢測rhGM-CSF成品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法是可行的。

應(yīng)用動態(tài)顯色法檢測rhGM-CSF成品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便等優(yōu)點，能很好地滿足質(zhì)控的要求，為完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

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[3] 陽怡，白兆平.各國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的比較[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2001，9（1）：41-42.

[4] 周飛.注射劑生產(chǎn)中熱原控制的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（28）：71-72.

[5] Levin J，Bang FB.Clottable protein in Limulus：its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin[J].Thromb Diath Haemorrh，1968，19（1）：186-197.

[6] 邱娟，盛振斌.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用進(jìn)展[J].臨床合理用藥，2011，4（3C）：128-129.

[7] 秦媛媛，吳彥霖，劉倩，等.三類體外熱原檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國藥事，2012，26（5）：507-512.

[8] 張永堅，馮聚錦.鱟試劑在藥品生產(chǎn)過程細(xì)菌內(nèi)毒素控制上的應(yīng)用[J].醫(yī)藥工程設(shè)計雜志，2003，24（1）：11-14.

[9] 國家藥典委員會.中國藥典（三部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95-98.

（收稿日期：2013-09-06 本文編輯：林利利）