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        一種基于酵母3’,5’-二磷酸核苷酸酶的蛋白親和層析純化體系

        2014-04-17 01:21:59浙江師范大學(xué)生化學(xué)院張曉楊洋孫梅好
        今日科技 2014年3期
        關(guān)鍵詞:二磷酸瓊脂糖腺苷

        浙江師范大學(xué)生化學(xué)院 張曉 楊洋 孫梅好

        一種基于酵母3’,5’-二磷酸核苷酸酶的蛋白親和層析純化體系

        蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究在后基因組時(shí)代尤為重要。為深入分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,

        研究者們需要分離純化大量不同的蛋白質(zhì)。親和層析具有高選擇性、高活性回收率和高純度等特點(diǎn)已成為純化蛋白質(zhì)等生物大分子最有效的技術(shù)之一。目前,常用的親和層析標(biāo)簽有多聚組氨酸、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶、麥芽糖結(jié)合蛋白等,但不同的標(biāo)簽各有其優(yōu)缺點(diǎn)。例如:研究發(fā)現(xiàn)如果表達(dá)的蛋白表面有幾個(gè)接近的組氨酸,此蛋白可能結(jié)合Ni-NTA介質(zhì),最終和目的蛋白一同洗脫下來(lái),導(dǎo)致多聚組氨酸標(biāo)簽純化的蛋白純度不夠;麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽的缺點(diǎn)為層析介質(zhì)價(jià)格較高且純化的目的蛋白純度較低;谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶標(biāo)簽的缺點(diǎn)為標(biāo)簽蛋白中半胱氨酸的氧化可導(dǎo)致目的蛋白凝集,且此蛋白與其配體的結(jié)合較慢,因此,我們需要降低上樣流速,延長(zhǎng)樣品的上樣時(shí)間等。最近,我們開(kāi)發(fā)了以酵母

        3’,5’-二磷酸核苷酸酶作為原核蛋白表達(dá)和分離純化的標(biāo)簽。本文主要對(duì)其蛋白純化原理和方法進(jìn)行總結(jié)。

        一、3’,5’-二磷酸核苷酸酶

        3’,5’二磷酸核苷酸酶水解3’,5’二磷酸腺苷或者3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸的3’磷酸基團(tuán),分別產(chǎn)生5’-單磷酸腺苷和腺苷5’-磷酰硫酸。此酶可通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)PAP的濃度,從而調(diào)節(jié)硫酸轉(zhuǎn)移酶、?;D(zhuǎn)移酶、RNA處理相關(guān)酶的活性,參與細(xì)胞的硫代謝和耐鹽性。來(lái)自酵母的3’,5’二磷酸核苷酸酶也稱為HAL2,屬于鎂離子依賴、鋰離子敏感的磷酸單酯酶超家族,可提高酵母的耐鹽性。HAL2和PAP具有較高的親和力,且市場(chǎng)上可買到PAP瓊脂糖,使得研究者可利用PAP瓊脂糖從酵母和豬肝臟中純化

        3’,5’二磷酸核苷酸酶,且分析表明KmPAP大約為0.7~17.0M。因此,3’,5’二磷酸核苷酸酶可以開(kāi)發(fā)為蛋白純化的親和標(biāo)簽。

        二、HAL2特性分析

        為深入分析HAL2是否可用來(lái)作為蛋白純化的標(biāo)簽,我們從酵母基因組中克隆HAL2基因,參照發(fā)表文獻(xiàn)方法進(jìn)行了蛋白純化。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明KmPAP和KcatPAP分別為0.25(±0.02)μM和10.8(±0.3)s-1。鈣離子作為鎂離子的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,1mM鈣離子可完全抑制HAL2對(duì)PAP的水解活性。我們利用熒光標(biāo)記的PAP類似物,進(jìn)行解離常數(shù)的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在pH8.0的條件下,其Kd為8 nM,且利用EGTA螯合鈣離子可有效解離HAL2·PAP復(fù)合體。另外,我們利用熒光標(biāo)記PAP類似物(mPAP),進(jìn)行mPAP與HAL2的結(jié)合測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在pH6.0,7.0,7.5,8.0和9.0條件下,其Kd分別是433(±139)nM,68.0(13.0)nM,7.6(±2.5)nM,8.5(±1.6)nM和50.9(±7.0)nM。在pH7.5和8時(shí),其親和能力最強(qiáng),其Kd約為8nM。

        三、親和層析步驟的合理設(shè)計(jì)

        根據(jù)相關(guān)結(jié)果,為更經(jīng)濟(jì)、有效地純化HAL2標(biāo)簽蛋白,我們認(rèn)為應(yīng)注意以下幾點(diǎn):

        1.溶液pH:經(jīng)研究,我們所選用溶液的pH7.5-8.0。

        2.胞內(nèi)廣泛存在的磷酸酶:純化體系的溶液中加入EDTA(10 mM)螯合鎂離子以消除磷酸酶活性。

        3.鈣離子的應(yīng)用:鈣離子可以促進(jìn)HAL2與PAP的結(jié)合,應(yīng)用EGTA螯合鈣離子進(jìn)行蛋白的洗脫。

        四、載體的構(gòu)建

        為了更有效的利用HAL2作為蛋白純化標(biāo)簽,我們將3’端有人鼻病毒3C蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列(R3CR)的HAL2連接入pET24a(NdeI和HindIII),構(gòu)建pHAL載體。為驗(yàn)證此載體是否有效可行,我們克隆了大腸桿菌APS激酶(APSkinase,APSK)基因,并利用HindIII和XhoI酶切位點(diǎn)插入pHAL,構(gòu)建HAL-APSK融合蛋白表達(dá)載體(pHAL-APSK)。PCR擴(kuò)增無(wú)R3CR序列的HAL2,并連接入pET24a(NdeI和HindIII),然后利用HindIII和XhoI位點(diǎn)插入人鼻病毒3C蛋白酶基因(R3C),構(gòu)建HAL3C蛋白酶表達(dá)載體(pHAL3C)。

        五、蛋白表達(dá)純化

        轉(zhuǎn)化表達(dá)載體至表達(dá)菌株BL21(DE3),利用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.5左右,加入0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,于16℃誘導(dǎo)表達(dá)16hr后,離心收集菌體。利用裂解液懸浮菌體,經(jīng)4℃溫浴1h后,超聲波破碎細(xì)胞。離心取上清液,上樣至經(jīng)裂解液平衡的PAP瓊脂糖凝膠柱;上樣結(jié)束后,用10倍體積的裂解液洗滌層析柱;然后,用10倍體積的高鹽洗滌液洗滌;再利用10倍洗滌液洗滌層析柱;最后利用洗脫液洗脫獲得融合蛋白HAL-APSK和HAL3C。HAL3C蛋白經(jīng)濃縮定量后,于-80℃冰箱保存?zhèn)?/p>

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