浙江師范大學生化學院 張曉 楊洋 孫梅好

一種基于酵母3’，5’-二磷酸核苷酸酶的蛋白親和層析純化體系

蛋白質是生命活動的主要承擔者。蛋白質的結構和功能的研究在后基因組時代尤為重要。為深入分析蛋白質的結構和功能，

研究者們需要分離純化大量不同的蛋白質。親和層析具有高選擇性、高活性回收率和高純度等特點已成為純化蛋白質等生物大分子最有效的技術之一。目前，常用的親和層析標簽有多聚組氨酸、谷胱甘肽轉硫酶、麥芽糖結合蛋白等，但不同的標簽各有其優(yōu)缺點。例如：研究發(fā)現(xiàn)如果表達的蛋白表面有幾個接近的組氨酸，此蛋白可能結合Ni-NTA介質，最終和目的蛋白一同洗脫下來，導致多聚組氨酸標簽純化的蛋白純度不夠；麥芽糖結合蛋白標簽的缺點為層析介質價格較高且純化的目的蛋白純度較低；谷胱甘肽轉硫酶標簽的缺點為標簽蛋白中半胱氨酸的氧化可導致目的蛋白凝集，且此蛋白與其配體的結合較慢，因此，我們需要降低上樣流速，延長樣品的上樣時間等。最近，我們開發(fā)了以酵母

3’，5’-二磷酸核苷酸酶作為原核蛋白表達和分離純化的標簽。本文主要對其蛋白純化原理和方法進行總結。

一、3’，5’-二磷酸核苷酸酶

3’，5’二磷酸核苷酸酶水解3’，5’二磷酸腺苷或者3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸的3’磷酸基團，分別產(chǎn)生5’-單磷酸腺苷和腺苷5’-磷酰硫酸。此酶可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)PAP的濃度，從而調(diào)節(jié)硫酸轉移酶、?；D移酶、RNA處理相關酶的活性，參與細胞的硫代謝和耐鹽性。來自酵母的3’，5’二磷酸核苷酸酶也稱為HAL2，屬于鎂離子依賴、鋰離子敏感的磷酸單酯酶超家族，可提高酵母的耐鹽性。HAL2和PAP具有較高的親和力，且市場上可買到PAP瓊脂糖，使得研究者可利用PAP瓊脂糖從酵母和豬肝臟中純化

3’，5’二磷酸核苷酸酶，且分析表明KmPAP大約為0.7～17.0M。因此，3’，5’二磷酸核苷酸酶可以開發(fā)為蛋白純化的親和標簽。

二、HAL2特性分析

為深入分析HAL2是否可用來作為蛋白純化的標簽，我們從酵母基因組中克隆HAL2基因，參照發(fā)表文獻方法進行了蛋白純化。動力學分析結果表明KmPAP和KcatPAP分別為0.25(±0.02)μM和10.8(±0.3)s-1。鈣離子作為鎂離子的競爭性抑制劑，1mM鈣離子可完全抑制HAL2對PAP的水解活性。我們利用熒光標記的PAP類似物，進行解離常數(shù)的測定，發(fā)現(xiàn)在pH8.0的條件下，其Kd為8 nM，且利用EGTA螯合鈣離子可有效解離HAL2·PAP復合體。另外，我們利用熒光標記PAP類似物（mPAP)，進行mPAP與HAL2的結合測定，發(fā)現(xiàn)在pH6.0，7.0，7.5，8.0和9.0條件下，其Kd分別是433(±139)nM，68.0(13.0)nM，7.6(±2.5)nM，8.5(±1.6)nM和50.9(±7.0)nM。在pH7.5和8時，其親和能力最強，其Kd約為8nM。

三、親和層析步驟的合理設計

根據(jù)相關結果，為更經(jīng)濟、有效地純化HAL2標簽蛋白，我們認為應注意以下幾點：

1.溶液pH：經(jīng)研究，我們所選用溶液的pH7.5-8.0。

2.胞內(nèi)廣泛存在的磷酸酶：純化體系的溶液中加入EDTA(10 mM)螯合鎂離子以消除磷酸酶活性。

3.鈣離子的應用：鈣離子可以促進HAL2與PAP的結合，應用EGTA螯合鈣離子進行蛋白的洗脫。

四、載體的構建

為了更有效的利用HAL2作為蛋白純化標簽，我們將3’端有人鼻病毒3C蛋白酶識別位點編碼序列（R3CR）的HAL2連接入pET24a（NdeI和HindIII），構建pHAL載體。為驗證此載體是否有效可行，我們克隆了大腸桿菌APS激酶（APSkinase，APSK）基因，并利用HindIII和XhoI酶切位點插入pHAL，構建HAL-APSK融合蛋白表達載體（pHAL-APSK）。PCR擴增無R3CR序列的HAL2，并連接入pET24a（NdeI和HindIII），然后利用HindIII和XhoI位點插入人鼻病毒3C蛋白酶基因（R3C），構建HAL3C蛋白酶表達載體（pHAL3C）。

五、蛋白表達純化

轉化表達載體至表達菌株BL21（DE3），利用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.5左右，加入0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達蛋白，于16℃誘導表達16hr后，離心收集菌體。利用裂解液懸浮菌體，經(jīng)4℃溫浴1h后，超聲波破碎細胞。離心取上清液，上樣至經(jīng)裂解液平衡的PAP瓊脂糖凝膠柱；上樣結束后，用10倍體積的裂解液洗滌層析柱；然后，用10倍體積的高鹽洗滌液洗滌；再利用10倍洗滌液洗滌層析柱；最后利用洗脫液洗脫獲得融合蛋白HAL-APSK和HAL3C。HAL3C蛋白經(jīng)濃縮定量后，于-80℃冰箱保存?zhèn)?/p>