方美丹 孫 剛 葉一冰

（浙江省臺州醫(yī)院，浙江臨海 317000）

·病例報告·

EDTA－K2致血小板溶解1例

方美丹 孫 剛 葉一冰

（浙江省臺州醫(yī)院，浙江臨海 317000）

EDTA－K2是臨床廣泛應(yīng)用的抗凝劑，但EDTA可使少數(shù)人的血小板發(fā)生聚集導(dǎo)致血細(xì)胞分析儀計數(shù)的血小板偏低，稱為EDTA依賴性假性血小板減少癥［1－2］，目前已有多篇文獻(xiàn)報道，而由于EDTA誘導(dǎo)血小板溶解致使血小板減少鮮有報道。作者于2013年9月發(fā)現(xiàn)1例EDTA溶解血小板的患者，隨著標(biāo)本放置時間的延長，血小板從聚集至完全溶解，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 體檢者，男，工人，52歲，血小板9×109／L，白細(xì)胞7.6×109／L，紅細(xì)胞4.12× 1012／L，血紅蛋白141g／L，其血小板直方圖降支呈波浪形漂移狀并有血小板聚集報警信息顯示（PLT Clumps）。經(jīng)推片復(fù)查和手工計數(shù)，初步判斷疑似血小板聚集并溶解。輔助檢查結(jié)果和臨床資料如下：生化、免疫及影像學(xué)等檢查均無異常，無淺表皮膚及黏膜出血點，近期無血小板減少等其它相關(guān)病史，近期無用藥史，臨床無相關(guān)癥狀及體征。

1.2 儀器與試劑 Sysmex XE－2100血液分析儀和SP－1000i自動推片機及配套試劑購于Sysmex公司，利用校準(zhǔn)品和質(zhì)控品對其校準(zhǔn)和質(zhì)量控制，嚴(yán)格按儀器操作規(guī)程進(jìn)行操作。Lecia顯微鏡購于南京高清智能有限公司，XB－K－25型血球計數(shù)板由上海安信光學(xué)儀器制造有限公司生產(chǎn)，EDTA－K2和枸櫞酸鈉抗凝管分別購于浙江拱東醫(yī)療科技有限公司和英國BD公司。

1.3 方法 應(yīng)用Sysmex XE－2100全自動血液分析儀分別對EDTA抗凝血和枸櫞酸鈉抗凝血進(jìn)行血小板計數(shù)并同時運用手工法進(jìn)行血小板計數(shù)。采集靜脈血2 mL和2.7 mL分別放入3.0 mg的EDTA－K2和0.3 mL枸櫞酸鈉（109 mmol／L）的試管中，同時采集左手無名指末梢血進(jìn)行手工推片鏡檢和血小板計數(shù)。在采血后0、10、30分鐘，1、2、3小時應(yīng)用Sysmex XE－2100全自動血液分析儀對EDTA抗凝血和枸櫞酸鈉抗凝血分別進(jìn)行檢測，同步使用SP－1000i自動推片機制作血涂片，以觀察血小板形態(tài)和評估數(shù)量，在上述各時間點使用枸櫞酸鈉抗凝血進(jìn)行血小板手工計數(shù)，手工計數(shù)血小板嚴(yán)格按《全國檢驗技術(shù)操作規(guī)程（第3版）》［3］進(jìn)行操作，同時設(shè)置無EDTA依賴性假性血小板減少的正常標(biāo)本1例為對照組，并在相應(yīng)的時間點制作血涂片，觀察血小板分布及形態(tài)以排除環(huán)境及放置時間可能對血小板聚集和溶解產(chǎn)生影響。本文中的標(biāo)本檢測及儲存的環(huán)境溫度均在室溫下進(jìn)行，以排除溫度對標(biāo)本可能產(chǎn)生的影響。

2 結(jié) 果

2.1 血小板計數(shù)結(jié)果 在3小時內(nèi)Sysmex XE－2100血液分析儀檢測EDTA抗凝標(biāo)本隨著時間延長，血小板數(shù)量逐漸減少；而Sysmex XE－2100血液分析儀檢測枸櫞酸鈉標(biāo)本和手工計數(shù)檢測結(jié)果無明顯變化；3種新鮮血液檢測的血小板數(shù)量基本一致，對照者的EDTA抗凝血的血小板在3小時內(nèi)無明顯改變。詳見表1。

表1 不同抗凝條件下血小板的計數(shù)結(jié)果（×109／L）

2.2 血小板直方圖信息 EDTA抗凝血放置30分鐘后Sysmex XE－2100的血小板直方圖降支呈波浪形漂移狀并有血小板聚集報警信息顯示（圖1a），而對照者未見明顯異常（圖1b）。

圖1 Sysmex XE－2100檢測體檢者和對照者的血小板直方圖信息

2.3 不同時間點EDTA抗凝血血涂片結(jié)果 新鮮血液血涂片中血小板散在分布，形態(tài)正常；10分鐘時可見幾個血小板聚集，形態(tài)基本正常；30分鐘血小板出現(xiàn)較強程度凝集，常見幾十至上百個凝集在一起，形態(tài)無明顯異常；1小時時可見聚集的血小板開始溶解，形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，但血小板顆粒尚清晰可見；2小時聚集的血小板溶解程度進(jìn)一步加劇，形態(tài)難以辨認(rèn)；3小時聚集的血小板基本溶解完全，形態(tài)模糊不清，幾乎無法識別。詳見封三彩圖1。由此可知，隨著EDTA抗凝血標(biāo)本放置時間逐漸延長，血小板從少量聚集到大量聚集，然后從部分溶解至完全溶解，整個過程大約需3小時。對照組各時間點的血小板血涂片中血小板散在分布，形態(tài)正常，無聚集、溶解現(xiàn)象發(fā)生。

3 討 論

EDTA依賴性假性血小板減少是由于抗凝血中EDTA誘導(dǎo)血小板中的特殊蛋白使血小板發(fā)生聚集，且在全自動血液分析儀上檢測時，其血小板發(fā)生聚集、堆積現(xiàn)象，使儀器不能確認(rèn)血小板而發(fā)生假性血小板計數(shù)減少［4－5］。但通過及時的手工計數(shù)可糾正儀器檢測誤差。目前尚未有EDTA致血小板溶解進(jìn)而引起血液分析儀檢測血小板減少的報道，并且該種血小板溶解導(dǎo)致計數(shù)減少無法通過手工計數(shù)進(jìn)行校正，更易導(dǎo)致臨床誤診誤治。因此，深入探討EDTA致使血小板減少的機制，分享臨床工作針對性處理方法以確保檢驗報告準(zhǔn)確無誤，從而為臨床正確診治提供堅實的基礎(chǔ)。

EDTA依賴性假性血小板減少癥機制目前尚不明確，可能與EDTA誘導(dǎo)血小板膜隱匿性抗原構(gòu)象改變，使該隱匿性抗原成為暴露性抗原有關(guān)。某些抗體與暴露的抗原結(jié)合，從而激活血小板膜中的磷酸脂酶，使其水解并釋放花生四烯酸（AA）、ADP、5－TH、膠原、凝血酶原、內(nèi)源性鈣離子等活性物質(zhì)。血小板膜糖蛋白GPⅠb與膠原產(chǎn)生粘附作用，同時PAF、ADP、TXA2等激活劑分別與粘附的血小板表面的相應(yīng)受體結(jié)合，通過G蛋白介導(dǎo)作用使血小板膜糖蛋白GPⅡb／Ⅲa復(fù)合物（αⅡbβ）激活?；罨腉PⅡb／Ⅲa是血小板膜上的纖維蛋白受體，纖維蛋白原作為二聚體可與兩個相鄰的血小板膜上GPⅡb／Ⅲa結(jié)合，產(chǎn)生“搭橋”作用，使血小板聚集。聚集的血小板進(jìn)一步引起結(jié)構(gòu)變化，并表達(dá)“配體”誘導(dǎo)的結(jié)合部位通過信號傳導(dǎo)，引起血小板細(xì)胞骨架蛋白的再構(gòu)筑，導(dǎo)致血小板扁平和伸展等變形改變，最終引起血小板溶解［6－8］。另外，EDTA溶液的pH與鹽類和標(biāo)本放置溫度也是導(dǎo)致血小板溶解的可能原因之一，如果標(biāo)本放置溫度較高可導(dǎo)致pH降低和EDTA鹽濃度增高，低pH和高EDTA鹽濃度可引起血小板腫脹、崩解，從而引起血小板溶解。而枸櫞酸鈉對血小板體積及其他凝血因子影響較小，基本不影響血小板計數(shù)和形態(tài)。收集更多樣本檢測pH值、EDTA鹽濃度、GPⅠb、GPⅡb／Ⅲa及相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子進(jìn)行統(tǒng)計分析，找出EDTA致部分患者的血小板溶解具體機制是本研究下一步努力的方向之一。

在一定時間內(nèi)，Sysmex XE－2100血液分析儀檢測EDTA抗凝標(biāo)本血小板與放置時間有關(guān)，而枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本與放置時間無關(guān)，這與文獻(xiàn)報道相似［9］。本病例血小板出現(xiàn)聚集的時間并影響計數(shù)約在標(biāo)本采集后10分鐘，血小板溶解的時間約在標(biāo)本采集后30分鐘至1小時之間，因此，及時的檢測標(biāo)本可以有效地避免EDTA致血小板溶解的計數(shù)誤差；另外，盡早顯微鏡復(fù)檢也可以避免因血小板溶解而導(dǎo)致的形態(tài)難以辨認(rèn)的問題。此類EDTA抗凝血標(biāo)本的血小板在手工計數(shù)時鏡下觀察到的血小板也是成堆、成團甚至溶解造成計數(shù)困難，建議對于此類標(biāo)本均需推片染色顯微鏡復(fù)查，且不能僅觀察體尾交接處，需認(rèn)真觀察全片尤其注重片尾尋找可以聚集或溶解點，然后重新現(xiàn)場復(fù)查血常規(guī)和血細(xì)胞手工計數(shù)，發(fā)現(xiàn)溶解時，需重新采集枸櫞酸鈉抗凝血進(jìn)行復(fù)查。

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