程明榮　張智平

摘 要 胰腺癌在消化道腫瘤中預(yù)后最差，化療極易耐藥，導(dǎo)致胰腺癌治療失敗的原因可能與胰腺癌干細(xì)胞有關(guān)。本文通過(guò)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，對(duì)胰腺癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)、分離、鑒定、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和靶向胰腺癌干細(xì)胞給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)行綜述，尤其是胰腺癌干細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)取得的較大進(jìn)展，為臨床胰腺癌的治療帶來(lái)新的希望。

關(guān)鍵詞 腫瘤干細(xì)胞 靶向給藥系統(tǒng) 耐藥 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 胰腺癌

中圖分類號(hào)：R735.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2014）06-0028-06

胰腺癌是目前預(yù)后最差的消化道腫瘤，其發(fā)病率與死亡率接近。雖然，胰腺癌的研究取得了重要進(jìn)展，但其預(yù)后仍很差，學(xué)者們?nèi)栽趯ふ倚碌闹委煼椒āＤ[瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）學(xué)說(shuō)的提出為尋找根治胰腺癌提供了新的理論基礎(chǔ)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在實(shí)體瘤或體外細(xì)胞系中存在的極少數(shù)細(xì)胞具有自我更新和多分化潛能，可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及放、化療耐藥中起到重要作用[1]。目前，胰腺癌干細(xì)胞已被證實(shí)具有自我更新、高致瘤性、活躍分化潛能和強(qiáng)耐藥性的特點(diǎn)，具有極高的惡性特點(diǎn)。

1 CSC的理論基礎(chǔ)

腫瘤由具有異質(zhì)性的組織組成，關(guān)于腫瘤的異質(zhì)性有兩種解釋：一種觀點(diǎn)認(rèn)為異質(zhì)性起源于不同類型的細(xì)胞，即具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞，這種細(xì)胞來(lái)源于天然多功能干細(xì)胞，還是正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)突變后轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉?xì)胞，尚不清楚；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤的異質(zhì)性來(lái)自克隆演化，突變的腫瘤細(xì)胞生存并繁殖，突變優(yōu)勢(shì)細(xì)胞群類似干細(xì)胞，具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的能力。兩種觀點(diǎn)并非相互獨(dú)立，而是具有內(nèi)在聯(lián)系。因此，CSC具有兩層含義[2-3]：①腫瘤起源于組織干細(xì)胞或胚胎細(xì)胞，具有自我更新的調(diào)節(jié)；②腫瘤是具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群。

2 CSC的簡(jiǎn)要發(fā)展史

早在150年前，病理學(xué)家Connnheim和Duramte就提出，組織中存在的極少數(shù)干細(xì)胞可能是腫瘤的起始細(xì)胞。1994年，Lapidot等[4]首次通過(guò)特異細(xì)胞表面標(biāo)志分離出人急性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有白血病干細(xì)胞才具有不斷自我更新，維持其惡性顯性的作用，首次證明了CSC的客觀存在，是人類第一次分離出CSC。2003年，Al-Hajj等[5]成功分離出人類乳腺癌干細(xì)胞，通過(guò)連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)，誘發(fā)出非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷性小鼠（NOD/SCID）的乳腺癌。2004年從中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中分離出具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞[6-7]，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。2005年，Saad等[8]從前列腺癌組織中成功分離出表型為CD44+/α2β1hi/CD133+的前列腺癌干細(xì)胞（約0.1%），其在體外有很高的增殖潛能并形成二次克隆，具有自我更新、無(wú)限增殖和分化的能力，在非雄激素依賴下長(zhǎng)期存活。2005年Kim等[9]從小鼠非小細(xì)胞肺癌模型的最初階段分離到支氣管肺泡干細(xì)胞。2007年Li等[10]首次從手術(shù)切除標(biāo)本中分離到CD44+CD24+ESA+胰腺癌干細(xì)胞，并通過(guò)小鼠的體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)證明其成瘤性，組織病理學(xué)特點(diǎn)與手術(shù)標(biāo)本類似，證實(shí)該干細(xì)胞具有高度的自我更新能力。

3 CSC的鑒定方法

目前鑒定胰腺癌干細(xì)胞的方法主要有細(xì)胞表面標(biāo)記、側(cè)群細(xì)胞（side populations，SP）實(shí)驗(yàn)、成球生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物致瘤性實(shí)驗(yàn)。

3.1 細(xì)胞表面標(biāo)志

主要利用細(xì)胞表面帶有特異性膜蛋白（即表面標(biāo)志）的特點(diǎn)，經(jīng)特異性抗體結(jié)合后，用流式細(xì)胞儀在熒光活化系統(tǒng)檢測(cè)下分選出熒光細(xì)胞。胰腺癌表面主要分子標(biāo)志為CD44+CD24+ESA+、CD133+、乙醛脫氫酶1（ALDH1）、c-Met等。Olempska等[11]應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATP 結(jié)合盒（ATP-binding cassette， ABC）G2在細(xì)胞株P(guān)anel、Panc89、Colo-357、Panc Tul和A818-6中均顯著高表達(dá)，而CD133僅高表達(dá)于Pane Tul和A818-6細(xì)胞株，因此認(rèn)為ABCG2+/CD133+細(xì)胞可能是胰腺癌干細(xì)胞，并且通過(guò)致瘤實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證[12]。Jimeno等[13]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)胰腺癌部分細(xì)胞高表達(dá)ALDH1，并且該細(xì)胞具有明顯的耐藥性，表現(xiàn)為CSC的特性。Li等[14]研究表明c-Met介導(dǎo)了胰腺癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，可作為一種表面標(biāo)志進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的分選。

3.2 SP細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CSC具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，能夠外排核酸染料Hoechst33342，而大部分非CSC不具備該蛋白。SP細(xì)胞實(shí)驗(yàn)利用該特性，通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)觀察具有CSC特性的不著色細(xì)胞。Zhou等[15]分離出人胰腺癌細(xì)胞株panc-1中的SP細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)用吉西他濱處理后，SP細(xì)胞的比例明顯升高，并且該SP細(xì)胞具有較高的克隆形成能力和更強(qiáng)的成瘤能力。

3.3 成球生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

CSC在特定的培養(yǎng)基可以形成干細(xì)胞球，從而特異富集CSC。其針對(duì)流式細(xì)胞分選出來(lái)的CSC的驗(yàn)證，將分選出的CSC進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)懸浮細(xì)胞球的生長(zhǎng)驗(yàn)證CSC的自我更新和分化能力。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)是對(duì)分選出的CSC進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，并繪制生長(zhǎng)曲線，通過(guò)對(duì)比普通腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度驗(yàn)證CSC的增殖能力。

3.4 動(dòng)物致瘤性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

是指用一定數(shù)量的待測(cè)腫瘤細(xì)胞懸液接種至NOD/SCID小鼠體內(nèi)，觀察是否會(huì)有腫瘤生成以及腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，用以評(píng)估待測(cè)細(xì)胞是否具有形成并維持腫瘤生長(zhǎng)及異質(zhì)性的能力。動(dòng)物體內(nèi)致瘤性實(shí)驗(yàn)是目前驗(yàn)證CSC的金標(biāo)準(zhǔn)。

4 胰腺癌干細(xì)胞的通路研究

胰腺癌干細(xì)胞與正常細(xì)胞一樣具有多分化潛能、自我更新能力和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些通路在胰腺癌干細(xì)胞的自我更新和自我調(diào)控中起到重要作用。在胰腺癌干細(xì)胞中表現(xiàn)得異常激活的通路有音猬因子（sonic hedgehog， Shh）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Notch、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、胰十二指腸同源蛋白1（PDX1）和B細(xì)胞特異性莫洛尼白血病毒插入位點(diǎn)-1（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site-1， BMI-1）等。

4.1 Shh通路

在人胰腺癌組織中的Shh通路異常激活，胰腺干細(xì)胞Shh通路的激活程度是胰腺癌組織的11倍[10]，并且發(fā)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Shh基因?qū)氲秸Ｒ认僦?，可使胰腺組織向胰腺癌前病變方向發(fā)展，出現(xiàn)胰腺常見(jiàn)的基因突變類型，如K-ras基因突變、Her2/neu過(guò)表達(dá)等[16]，利用Shh通路抑制劑環(huán)巴胺抑制后，體外胰腺細(xì)胞增值明顯抑制[17]。

4.2 BMI-1通路

原癌基因BMI-1是轉(zhuǎn)錄抑制因子基因polycomb家族成員，它通過(guò)調(diào)節(jié)端粒酶的活性控制細(xì)胞的增殖和凋亡。參與正常干細(xì)胞調(diào)控作用的BMI-1在CSC的維持和自我更新中同樣具有重要作用，如乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中的CSC均明顯上調(diào)。有學(xué)者證實(shí)胰腺癌細(xì)胞（CD44+CD24+ESA+）中的BMI-1 mRNA具有異常表達(dá)，并認(rèn)為在胰腺癌干細(xì)胞中的自我更新的維持上具有重要作用[18]。

4.3 Notch信號(hào)通路

Notch是非常保守的信號(hào)系統(tǒng)，其受體多與相鄰細(xì)胞間的膜結(jié)合配體結(jié)合而被激活。Notch途徑的激活過(guò)程是γ-分泌酶作用于Notch受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域從膜上脫落，移位到細(xì)胞核調(diào)控基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞增值、分化和轉(zhuǎn)移過(guò)程。Notch通路的異常與胰腺癌干細(xì)胞的自穩(wěn)具有明顯的相關(guān)性[19]，其確切關(guān)系仍在進(jìn)一步的研究中。

4.4 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路

mTOR信號(hào)通路是新近發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)信號(hào)通路，該通路可匯聚和整合來(lái)自營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、能量和環(huán)境壓力對(duì)細(xì)胞的刺激信號(hào)，進(jìn)而通過(guò)下游效應(yīng)器真核細(xì)胞始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）和核糖體S6蛋白激酶（S6KS）調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)該通路與胰腺癌干細(xì)胞的自我增值具有明顯的相關(guān)性。Mueller等[20]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌干細(xì)胞的mTOR信號(hào)通道異常活躍，雷帕霉素是mTOR的抑制物，阻斷該信號(hào)通道可以抑制部分胰腺癌干細(xì)胞（CD133+）的生長(zhǎng)，為了更好地殺滅干細(xì)胞，研究人員將雷帕霉素、環(huán)杷明和吉西他濱三藥聯(lián)合（CRG），發(fā)現(xiàn)對(duì)CSC的殺傷力極強(qiáng)，可以明顯延長(zhǎng)無(wú)瘤生存時(shí)間，提示mTOR信號(hào)通路積極參與了胰腺癌干細(xì)胞的自我更新與分化。

4.5 PDX1途徑

PDX1是胰腺發(fā)育早期起重要作用的啟動(dòng)基因表達(dá)的蛋白，在胰腺自我更新時(shí)，PDX1可在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞中短暫表達(dá)，在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)[21-22]，其表達(dá)程度又與腫瘤的大小、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)這些特性都與CD133+，CXCR4+的胰腺癌CSC的特性非常吻合[23-24]。

4.6 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/侵襲前端趨化因子受體-4（SDF-1/CXCR4）軸

SDF-1/CXCR4軸無(wú)論是胚胎時(shí)期胰腺的形成還是損傷胰腺的修復(fù)均具有重要作用，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移并促進(jìn)胰管形成。有研究表明在胰腺癌CSC發(fā)生轉(zhuǎn)移之前，使用特異性抑制劑（AMD-3100或AMD-070）阻斷CXCR4的表達(dá)，會(huì)明顯降低胰腺癌的轉(zhuǎn)移發(fā)生率[25- 26]。

5 胰腺癌干細(xì)胞與轉(zhuǎn)移

胰腺癌一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后極其不佳，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程涉及多種活性因子及酶的參與，并不是所有的胰腺癌細(xì)胞都具備轉(zhuǎn)移的能力，只有其中的一小部分會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移并最終形成轉(zhuǎn)移瘤。Wellner等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1（ZEB1）是胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的激活因子，ZEB1通過(guò)抑制細(xì)胞microRNA-200的表達(dá)，阻止細(xì)胞的正常分化，激活細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并使癌細(xì)胞具備干細(xì)胞的表型，從而使癌細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。因此提出ZEB1-microRNA-200反饋弧可以作為治療胰腺癌的靶點(diǎn)。Hermann等[28]發(fā)現(xiàn)侵襲性胰腺癌標(biāo)本中，CD133胰腺癌干細(xì)胞與CXCR4+呈共表達(dá)。CD133+CXCR4+細(xì)胞和CD133+CXCR4-細(xì)胞均可在小鼠體內(nèi)形成腫瘤，但是僅CD133+CXCR4+細(xì)胞的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，提示可能存在兩種不同表型的胰腺癌干細(xì)胞，即穩(wěn)定型干細(xì)胞和游走型干細(xì)胞；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中阻斷CXCR4胰腺癌干細(xì)胞與化療耐藥信號(hào)通路可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，這對(duì)臨床治療胰腺癌轉(zhuǎn)移有重要的指導(dǎo)意義。但目前仍未明確CXCR4+細(xì)胞來(lái)源于何處，是干細(xì)胞最初就富有的一種亞克隆，還是在腫瘤發(fā)展過(guò)程中干細(xì)胞受到微環(huán)境影響誘導(dǎo)產(chǎn)生的新亞型，因?yàn)檫@涉及如何確定通過(guò)抑制CXCR4+胰腺癌干細(xì)胞來(lái)阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的治療策略，究竟是直接消滅CXCR4+的干細(xì)胞亞群，還是誘導(dǎo)干細(xì)胞分化進(jìn)而減少干細(xì)胞抑制轉(zhuǎn)移。Singh等[29]使用吉西他濱聯(lián)合AMD3100封閉胰腺癌細(xì)胞CXCR4后，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移都受到了抑制，很好的驗(yàn)證了Hermann的研究成果。

6 胰腺癌干細(xì)胞與耐藥性

耐藥的腫瘤細(xì)胞與CSC具有許多相似的特征，如大多處于細(xì)胞周期的G0期，不進(jìn)入增殖周期，而大部分化療藥物作用于細(xì)胞增殖期，不能殺滅處于G0期的癌細(xì)胞，這些細(xì)胞的細(xì)胞膜ATP泵耐藥分子，具有極強(qiáng)的自我修復(fù)DNA損傷和抗凋亡的能力。越來(lái)越多的研究顯示胰腺癌干細(xì)胞介導(dǎo)了其對(duì)放化療的抵抗，Hermann等[30]采用吉西他濱干預(yù)CD133+CSC，發(fā)現(xiàn)其對(duì)吉西他濱明顯耐藥，干預(yù)5 d后其比例明顯上升，達(dá)細(xì)胞總數(shù)的50%。他們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吉西他濱具有抑制胰腺癌生長(zhǎng)的作用，但CD133+CSC的比例明顯升高，進(jìn)一步說(shuō)明CD133+CSC的耐藥性。Wang等[31]的研究支持Hermann的研究結(jié)果。Lee等[18]通過(guò)CD44+CD24+ESA+CSC移植瘤模型也證實(shí)胰腺癌干細(xì)胞對(duì)放、化療抵抗。他們用放療聯(lián)合吉西他濱化療干預(yù)上述模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，移植瘤的生長(zhǎng)不僅不被抑制反受到刺激，深入研究表明CD44+CD24+ESA+CSC在吉西他濱的作用下不會(huì)凋亡，僅停止增殖，一旦停止用藥，該細(xì)胞亞群又開始增殖和分化。Kallifatidis等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花提取物萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）能增強(qiáng)化療藥物對(duì)胰腺癌CSC的殺傷作用，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制ALDH1和Notch-1表達(dá)可誘導(dǎo)凋亡和抑制細(xì)胞的增殖；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SFN可以抑制種植瘤在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，且無(wú)不良反應(yīng)。Rausch等[33]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤靶向藥物索拉非尼（Sorafenib）可以抑制胰腺癌CSC的增殖、分化和轉(zhuǎn)移，在種植瘤模型研究中，發(fā)現(xiàn)索拉非尼可以抑制種植瘤的生長(zhǎng)和血管形成，但卻可以激活胰腺癌CSC中的核因子-κB（NF-κB），NF-κB是一種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，可以被炎性因子、生長(zhǎng)因子或趨化因子等激活，NF-κB一旦被激活，就會(huì)使胰腺癌CSC死灰復(fù)燃，而將SFN與索拉非尼聯(lián)用，可以阻止NF-κB的激活，抑制癌細(xì)胞克隆增殖，徹底消滅胰腺癌CSC。

7 胰腺干細(xì)胞的臨床意義

腫瘤現(xiàn)有的藥物治療，雖然具有一定的療效，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制和控制作用，無(wú)論對(duì)轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶，均是暫時(shí)的控制，大多數(shù)患者均可以發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中最為關(guān)鍵的問(wèn)題是沒(méi)有徹底清除CSC。因此，消滅非成瘤細(xì)胞，可以使腫瘤縮小，但不能治愈，如果藥物直接針對(duì)CSC，直接將CSC進(jìn)行清除和誘導(dǎo)CSC進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將對(duì)腫瘤的治療是一個(gè)歷史性的改變。因此針對(duì)胰腺癌干細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，會(huì)導(dǎo)致新的治療腫瘤方法的誕生。Mueller等[20]報(bào)道應(yīng)用CRG三聯(lián)療法治療胰腺癌干細(xì)胞具有明顯的療效，但仍有一定的臨床風(fēng)險(xiǎn)，如雷帕霉素和環(huán)杷明聯(lián)用傳統(tǒng)化療藥有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，可能對(duì)其他器官的功能同樣具有抑制作用。當(dāng)然Mueller等[20]的CRG三聯(lián)療法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示裸鼠尚能耐受該療法，但應(yīng)用于臨床還需大量的臨床前實(shí)驗(yàn)。雖然此療法未進(jìn)入臨床，但其優(yōu)勢(shì)尚存，CRG三聯(lián)療法中的藥物均已經(jīng)在臨床使用，可以減少巨大的工作量，而且各自的毒副作用已知，僅需研究聯(lián)合應(yīng)用后的毒副作用，相對(duì)工作量減輕。

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（收稿日期：2014-01-07）