鄒榮軍，梁祖鳳，馬騰飛，唐新宇，呂 紅綜述，田 晶，齊 玲審校 (吉林醫(yī)藥學院:.0級臨床本科班，.0級預防醫(yī)學本科班，3.生理教研室，.病理教研室，吉林 吉林 303)

缺血性腦血管疾病因其發(fā)病率、致殘率和致死率高，與心臟病和惡性腫瘤一同構成了人類最常見的三大致死性疾病。近年來，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率各年齡層中均呈不斷增長趨勢。在腦缺血疾病中神經(jīng)細胞凋亡后所引起的腦損傷發(fā)揮著重要的作用，這是缺血性腦損傷的重要發(fā)病機制之一[1-2]。神經(jīng)細胞凋亡是指在某些生理或病理因素的刺激下，細胞膜信號轉導系統(tǒng)被激活，進而啟動相關凋亡調(diào)控因子，最終導致細胞死亡的過程。神經(jīng)細胞凋亡是由凋亡因素的激活和抗凋亡因素的抑制兩方面來共同決定的。而線粒體作為重要的能量供應器，在凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用[3]。

1 神經(jīng)細胞凋亡與缺血性腦血管病

神經(jīng)細胞凋亡是一個程序性細胞死亡的過程，主要經(jīng)歷了3個時期[4]：第一個時期是起始期，靶細胞接受死亡指令，開始啟動相關因子，同時抑制某些因子從而發(fā)動程序性死亡；第二個時期是整合期，細胞內(nèi)出現(xiàn)一系列的形態(tài)和生化變化，如核凝集、胞體縮小、染色體DNA降解、形成DNA小片段等；第三個時期是執(zhí)行期，形成的凋亡小體被周圍組織的吞噬細胞消化吞噬，完成了整個凋亡過程。神經(jīng)細胞的凋亡有其特定的通路，其中主要包括死亡受體介導通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[5]。

大量學者通過實驗已經(jīng)證實了神經(jīng)細胞凋亡與腦缺血性腦血管病發(fā)生發(fā)展呈密切相關。如Jadas V等[6]通過對30名新生兒腦病的兒童進行MRI檢測，發(fā)現(xiàn)這群兒童的大腦實質(zhì)均有組織細胞凋亡的跡象，猜想這可能與胎兒期臍帶纏繞或是藥物作用導致胎兒腦組織缺血缺氧而發(fā)生神經(jīng)細胞凋亡有關。Yu Ji Hea等[7]通過對腦血管病變損傷引起的缺血性腦病的大鼠注射促紅細胞生成素和粒細胞集落刺激因子后，發(fā)現(xiàn)通過改善神經(jīng)細胞氧利用和攝取能力，可以抵抗神經(jīng)細胞的凋亡，對于缺血性腦病可以發(fā)揮一定的治療作用。Mehta等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當腦組織發(fā)生缺血損傷后，缺血中心區(qū)細胞主要以壞死為主，缺血周圍區(qū)細胞則以凋亡為主。

細胞一旦發(fā)生壞死是難以逆轉的，但凋亡是可以通過上游信號調(diào)節(jié)進行干預的，因此，腦缺血的治療策略正是以減少凋亡細胞數(shù)目和保護神經(jīng)細胞的活性為目標。

2 線粒體通路的研究進展

線粒體通路是細胞凋亡的一條重要途徑。當各種損傷因子使線粒體正常的結構受到破壞，線粒體出現(xiàn)腫脹變形，嵴彎曲，膜破裂、減少或缺損，基質(zhì)外流后導致某些凋亡蛋白釋放，進而激活下游的凋亡調(diào)控因子，細胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體通路引起凋亡的發(fā)生主要與B細胞淋巴瘤蛋白-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)家族促凋亡蛋白增多[9-10]、線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeablity pore，MPTP)開放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl asparate specific proteinase，caspase)激活等因素有關。

2.1 Bcl-2家族促凋亡蛋白

Bcl-2家族是目前最受關注的凋亡相關蛋白家族，可分為抗凋亡成員和促凋亡成員?？沟蛲龀蓡T包括Bcl-2、Bcl-xl、bfl-1/Al等，它們主要作用于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜；促凋亡成員主要包括Bax、Bak和Bad等，主要是抵消抗凋亡蛋白所形成的異源二聚體阻止細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)釋放的作用，間接促進凋亡[11]。Bcl-2和Bax在細胞內(nèi)組成了一個平衡體系，共同受凋亡因子的調(diào)控。Bax增高可以促進細胞凋亡，Bcl-2增高則抑制細胞凋亡。同時Bax和Bcl-2相互作用既可以形成同源二聚體，也可以形成異源二聚體；當形成同源二聚體時可阻止MPTP的開放。

在正常生理情況下，細胞通過表達Bcl-2來介導細胞核內(nèi)谷胱甘肽的聚集，抵消細胞內(nèi)損傷因子的氧化刺激，改變了細胞核內(nèi)氧化還原反應系統(tǒng)的平衡；同時也作用于線粒體膜，使膜穩(wěn)定、防止促凋亡相關蛋白釋放，阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放而對細胞起一定保護作用[12]。在神經(jīng)細胞中，當有凋亡因素的誘導作用時，Bax就會從胞液遷移至線粒體外膜，與Bcl-2形成異源二聚體從而介導線粒體外膜形成孔道，使氧自由基增多、Ca2+超載、CytC等凋亡蛋白釋放從，而介導細胞凋亡的發(fā)生[13]。

2.2 MPTP的開放

線粒體膜通透性主要受MPTP的開放與關閉來控制[14]。MPTP是由位于線粒體內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸轉位子(adenine nucleotide translocator，ANT)和位于外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)組成。其中VDAC是線粒體進行ATP、ADP等物質(zhì)交換的重要通道，表面有許多蛋白酶、凋亡相關蛋白的受體，如Bax、Bcl-2、Bcl-xl等；ANT主要感受線粒體基質(zhì)內(nèi)氧自由基、Ca2+濃度、pH等的刺激，同時在其側面還有具有折疊酶活性的重組人親環(huán)素D(HumanCyclophilin-D，CypD)。

在正常生理狀況下，MPTP受Bcl-2為主的抗凋亡蛋白和Bax為主的促凋亡蛋白的共同調(diào)節(jié)。當Bax與線粒體膜上的Bcl-2結合后形成同源二聚體，主要作用于VADC以阻止MPTP的開放；當細胞受到損傷刺激后將會出現(xiàn)一系列的病理改變。一方面，線粒體可通過呼吸鏈生成大量氧自由基，直接作用于線粒體內(nèi)膜使膜電位降低，CypD發(fā)揮折疊效應使蛋白折疊并聚集于親水面，這種蛋白的折疊聚集主要是為了控制溶質(zhì)分子穿入線粒體膜。在損傷程度輕時這種以CypD為主的折疊蛋白形成的復合物尚能夠維持MPTP孔處于關閉狀態(tài)，當Ca2+濃度達到一定閾值后，線粒體孔道開放，導致線粒體嵴破裂、腫脹變大、CytC釋放，這是線粒體可控性開放；但是當有高濃度的誘導物直接刺激作用時，MPTP孔會直接打開進入不可控性開放，而且這個過程不受Ca2+的調(diào)控[15-16]。另一方面，Bid、Bad等促凋亡蛋白在達到一定濃度閾值時能直接或間接誘導Bax、Bak發(fā)生構象變化，通過暴露跨膜閾而易位到線粒體外膜上并在外膜上聚集形成脂質(zhì)孔，使MPTP開放異常、通透性增加、線粒體膨脹[17-18]。最終導致CytC、凋亡誘導因子(Apoptosis-inducing factor，AIF)等的釋放，之后激活caspase-9[19-20]，并在ATP作用下聚集結合形成凋亡復合物，最終激活caspase-3引起caspase級聯(lián)反應，細胞凋亡發(fā)生[21-24]。

2.3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族蛋白

caspases是直接引起細胞凋亡的蛋白酶系統(tǒng)，在凋亡路徑中發(fā)揮了重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)有14個Caspase家族成員，其中caspase-3、caspase-8及caspase-9是凋亡通路上的三個關鍵因子。caspase-3能夠特異性地裂解天冬氨酸殘基后的肽鍵，參與凋亡信號的轉導；在caspases“級聯(lián)效應”中位于下游，是凋亡信號轉導途徑中最關鍵的執(zhí)行者[25]。

當細胞受到損傷刺激后，細胞內(nèi)的caspase-8、caspase-9前體被激活從而激活了caspase-3前體，隨之細胞進入caspase級聯(lián)反應，凋亡發(fā)生。體外實驗發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)caspase-9能激活所有的caspase家族成員[26-27]。由于xcaspase-3在細胞凋亡中地位的重要和特殊，在實驗研究當中常常將caspase-3作為細胞凋亡的標記[4]。在研究線粒體凋亡通路時將caspase-3和caspase-9共同作為標記物則更有意義。

3 線粒體通路與神經(jīng)細胞凋亡密切相關

線粒體是真核細胞內(nèi)重要的雙膜細胞器，其內(nèi)膜和外膜系統(tǒng)將線粒體分為四部分，即外膜、內(nèi)膜、膜間隙和基質(zhì)。這四部分一方面通過氧化磷酸化等代謝途徑為細胞提供ATP；另一方面參與啟動凋亡，特別是膜間隙中的某些蛋白，如Cyt C、 脫氧核糖核酸酶、核酸內(nèi)切酶G和AIF等。

大量研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷后激活線粒體凋亡傳導通路在神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。線粒體損傷在腦缺血疾病中體現(xiàn)的特別明顯，比如張潔[28]通過對大鼠行雙側頸總動脈反復結扎并降壓4周后建立血管性癡呆模型，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)線粒體出現(xiàn)明顯的腫脹、破壞。袁燕[29]通過取大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞培養(yǎng)，并給予一定劑量的鎘使其對皮質(zhì)神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性損傷，發(fā)現(xiàn)在凋亡過程中神經(jīng)細胞線粒體腫脹變形，嵴彎曲變形，膜發(fā)生破裂、減少或缺損，基質(zhì)外流，并且線粒體參與了大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的凋亡。馮金洲[30]在實驗中建立了小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎模型，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其脊髓神經(jīng)元內(nèi)線粒體出現(xiàn)明顯腫脹、空泡樣變甚至溶解等；發(fā)現(xiàn)線粒體通過非免疫損傷機制參與細胞的凋亡過程。而李妍[31]在證實錳對多巴胺神經(jīng)元毒性作用的過程中發(fā)現(xiàn)，其主要的損傷機制是其阻礙線粒體的電子傳遞鏈，使其自氧化而進入凋亡過程。

通過保護神經(jīng)細胞線粒體的功能和結構，就能發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯、白附子提取物、三七總皂苷等通過直接清除氧自由基，保護神經(jīng)細胞的線粒體可以發(fā)揮直接抗凋亡的作用[32-34]。海風藤和姜黃素等可以通過穩(wěn)定線粒體膜電位，保護線粒體結構而起到抗凋亡的作用[35-36]。山楂葉總黃酮和黃芪等通過抑制一系列酶的活性而減少細胞色素C的釋放來保護神經(jīng)細胞[37-38]。

由此可見治療和預防缺血性腦損傷疾病的發(fā)生中，保護線粒體結構和功能的穩(wěn)定來抗神經(jīng)細胞凋亡是我們進行實驗研究和藥物作用的重要靶點。

4 展 望

綜上所述，神經(jīng)細胞凋亡與缺血性腦損傷疾病發(fā)生密切相關，在凋亡發(fā)生過程中線粒體凋亡傳導通路的激活是凋亡發(fā)生的重要原因。通過對線粒體通路的研究可以加深我們對神經(jīng)細胞凋亡的認識，對缺血性腦損傷疾病的原因有更好的了解，更重要的是可為臨床治療及預防提供重要的理論基礎。隨著分子手段和基因治療的發(fā)展，我們相信在未來的某一天這類缺血性腦損傷疾病的治愈率將能大大提高。

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