王麗，連云，趙向東，李浩，朱陽(yáng)泉

（鎮(zhèn)江市中心血站輸血研究室，江蘇鎮(zhèn)江212004）

微量梯形板在Rh表型抗原自動(dòng)化檢測(cè)中的應(yīng)用

王麗，連云，趙向東，李浩，朱陽(yáng)泉*

（鎮(zhèn)江市中心血站輸血研究室，江蘇鎮(zhèn)江212004）

目的：探討微量梯形板在Rh表型抗原自動(dòng)化檢測(cè)中的應(yīng)用效果。方法：在Xantus雙機(jī)械臂加樣儀及AK03B數(shù)字血型儀組成的全自動(dòng)血型檢測(cè)平臺(tái)上，每批布局8塊微量梯形板，每塊微板檢測(cè)24份血樣。編制加樣程序，優(yōu)化相關(guān)檢測(cè)參數(shù)，同時(shí)檢測(cè)1 198份隨機(jī)獻(xiàn)血者血樣及5份Rh（D）陰性固定獻(xiàn)血者血樣的Rh表型抗原（C、c、D、E、e）。結(jié)果：在被檢血樣紅細(xì)胞稀釋濃度為2%、5種檢測(cè)試劑（IgM抗-C、c、D、E、e）分別稀釋20倍（最終效價(jià)為1∶6．4）、室溫靜置反應(yīng)時(shí)間為40 min等條件下，與試管法比較，1 203份血樣Rh表型自動(dòng)化檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。結(jié)論：微量梯形板用于Rh表型抗原檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，適用于大批量標(biāo)本檢測(cè)。該方法具有快速準(zhǔn)確、試劑耗量低、結(jié)果便于電腦統(tǒng)計(jì)管理等優(yōu)點(diǎn)。

微量梯形板；Rh表型抗原；聯(lián)合檢測(cè)；自動(dòng)化

Rh血型在臨床輸血及新生兒溶血病診治中具有重要意義。Rh血型系統(tǒng)有5個(gè)重要抗原，即C、c、D、E、e，目前檢測(cè)方法以手工試管法和卡式法為主，兩者檢測(cè)試劑成本較高，且速度慢，不適用于大批量標(biāo)本。120孔微量梯形板是奧林巴斯公司研制的專用于血型試驗(yàn)的高科技產(chǎn)品，通過(guò)紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體在微量梯形孔中的自然沉降反應(yīng)，紅細(xì)胞在抗體的橋聯(lián)和自然重力作用下平鋪于V型梯形孔的底部，形成相對(duì)均勻的紅細(xì)胞層面；如果紅細(xì)胞未與相應(yīng)抗體結(jié)合，則在重力作用下滑落于梯型微孔底部中央形成一個(gè)致密的圓點(diǎn)。通過(guò)血型儀對(duì)微孔底部自動(dòng)掃描成像，由判讀程序?qū)D像快速分析，準(zhǔn)確得出結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程自動(dòng)化。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本來(lái)源

1 203份血樣（其中有5份為應(yīng)急招募的Rh陰性固定獻(xiàn)血者血樣）均來(lái)自鎮(zhèn)江地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者，每份血樣容量為3～5 mL，EDTA-K2充分抗凝，檢測(cè)前3 000×g離心6 min。

1．2 儀器與試劑

120孔微量梯形板（日本Olympus公司）、Xantus雙機(jī)械臂全自動(dòng)加樣儀與AK03B數(shù)字血型儀組成的全自動(dòng)血型檢測(cè)平臺(tái)（深圳愛康電子有限公司），紅細(xì)胞稀釋板（深圳愛康電子有限公司），單克隆IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e試劑（英國(guó)Millipore公司），單克隆IgM抗-D試劑（加拿大Dominion公司）。

1．3 方法

1．3．1 布局檢測(cè)平臺(tái) 在Xantus雙機(jī)械臂全自動(dòng)血型檢測(cè)平臺(tái)上，布局8塊120孔微量梯形板，每份標(biāo)本5個(gè)Rh抗原的檢測(cè)分別占用5個(gè)微孔，每塊微板可檢測(cè)24（120／5）份標(biāo)本，每批最多可檢測(cè)192（8×24）份標(biāo)本。

1．3．2 編制檢測(cè)程序 取一定量生理鹽水＋被檢血樣壓積紅細(xì)胞于稀釋板上充分混勻，得稀釋被檢紅細(xì)胞，吸取125μL相應(yīng)濃度紅細(xì)胞于梯形微板的5個(gè)檢測(cè)微孔中，每孔分配25μL；再分別吸取經(jīng)預(yù)稀釋的5種Rh血型試劑25μL于對(duì)應(yīng)的5個(gè)孔中。設(shè)置后機(jī)械臂自動(dòng)夾取微板在振蕩器上中速混勻10 s，原位室溫靜置40 min。設(shè)置血型儀自動(dòng)掃描判讀：紅細(xì)胞均勻分布在V型孔底的判為陽(yáng)性，紅細(xì)胞集中沉降于孔底中央的判為陰性。

1．3．3 優(yōu)化相關(guān)檢測(cè)參數(shù) 吸取生理鹽水量分別為990、490、320μL，被檢血樣壓積紅細(xì)胞各10μL，得紅細(xì)胞濃度分別為1%、2%和3%。用生理鹽水對(duì)試劑原液進(jìn)行10倍、20倍及30倍預(yù)稀釋（原效價(jià)1∶128），稀釋后效價(jià)分別為1∶12．8、1∶6．4及1∶4．3。每孔加入反應(yīng)液的總量參考文獻(xiàn)［1］，以充滿微孔V型底部容積為宜。測(cè)量微孔V型底部的容積約為50μL，加被檢稀釋紅細(xì)胞和預(yù)稀釋試劑各25μL。

2 結(jié)果

2．1 微板底部掃描結(jié)果

經(jīng)自然沉降反應(yīng)后，不同反應(yīng)結(jié)果微孔底部掃描圖像見圖1，抗體過(guò)量或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體不足等均可能造成假陰性結(jié)果。

2．2 被檢血樣表型結(jié)果

被檢紅細(xì)胞與5種抗體反應(yīng)格局可得18種表型結(jié)果，1 203份獻(xiàn)血者血樣共檢出12種表型，分布情況見表1，其中10例Rh陰性經(jīng)確認(rèn)試驗(yàn)均符合。

2．3 紅細(xì)胞與抗體濃度的優(yōu)化

不同濃度被檢紅細(xì)胞與不同效價(jià)抗體進(jìn)行雙盲試驗(yàn)，檢測(cè)1 203份獻(xiàn)血者血樣Rh表型抗原。與試管法結(jié)果比較，當(dāng)被檢紅細(xì)胞濃度為2%，試劑效價(jià)為1∶6．4時(shí)，5種表型結(jié)果符合率均為100%，見表2。

3 討論

Rh血型系統(tǒng)是已知人類最具廣泛多態(tài)性和產(chǎn)生免疫性的系統(tǒng)之一，其重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)。Rh血型系統(tǒng)有45種不同的抗原，其中有5個(gè)抗原免疫原性較強(qiáng)，即D、E、c、C及e。根據(jù)紅細(xì)胞上有無(wú)D抗原，將其分為Rh陽(yáng)性和Rh陰性［2］。我國(guó)漢族人群Rh陰性比例極低，只占0．34%，因此臨床上抗-D引起的溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病并不多見。近年來(lái)，隨著臨床用血量的增加，Rh系統(tǒng)的其他4個(gè)抗原引起的溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病屢見報(bào)道［3－4］。特別是E和c，在漢族人群中占有較高的頻率［5］，因此臨床上約有50%的輸血為E和c的不合性輸血。E和c的不合性輸血，特別是多次或大量的輸血，易導(dǎo)致患者產(chǎn)生抗-E和抗-c，如再次輸血就可能產(chǎn)生嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)。孕婦產(chǎn)生抗-E和抗-c易造成胎兒或新生兒嚴(yán)重的溶血病［6］。因此，對(duì)于一些需反復(fù)輸血的特殊患者和有生育能力的女性患者，Rh表型相合輸血可以避免產(chǎn)生同種免疫性抗體。

目前Rh表型檢測(cè)常用的方法有鹽水試管法和微柱凝膠法。面對(duì)大量患者和獻(xiàn)血者，同時(shí)檢測(cè)5個(gè)抗原，這兩種方法工作量大、操作煩瑣且檢測(cè)成本高，手工記錄易出錯(cuò)。微量梯形板技術(shù)的運(yùn)用，徹底解決了手工法檢測(cè)血型的不足，微孔的底部根據(jù)紅細(xì)胞直徑設(shè)計(jì)了特有的階梯形，每個(gè)階梯的寬度與紅細(xì)胞直徑相當(dāng)，便于橋聯(lián)紅細(xì)胞的平鋪，沒有抗體橋聯(lián)的紅細(xì)胞則滑落孔底。通過(guò)軟件對(duì)微孔底部成像的快速分析判斷得出準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。因微量梯形板對(duì)結(jié)果的判斷采用了特有的底部成像技術(shù)，因此輕中度的溶血和脂血標(biāo)本對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。

微孔底部采用了V字型梯形結(jié)構(gòu)，對(duì)于陽(yáng)性反應(yīng)孔，最佳的平面掃描圖像中紅細(xì)胞平鋪于微孔底部；當(dāng)紅細(xì)胞濃度和反應(yīng)體積一定時(shí)，最佳結(jié)果主要取決于反應(yīng)液中抗體的效價(jià)。效價(jià)過(guò)高，紅細(xì)胞將凝集成小塊滑落孔底造成假陰性；效價(jià)過(guò)低，紅細(xì)胞不能形成均一的橋聯(lián)，則有部分紅細(xì)胞沉于孔底，仍造成結(jié)果的假陰性。因此，要得到理想的檢測(cè)結(jié)果，必須對(duì)試劑原液和被檢紅細(xì)胞用生理鹽水作不同程度稀釋后進(jìn)行交叉試驗(yàn)。

由于本法有較高的靈敏度，微板的防污染不可輕視，一般采用配制清潔液浸泡過(guò)夜，加樣儀使用一次性加樣針可避免污染問題。

［1］ 彭小華，何婧婷，李麗平．120孔梯形微板法血型自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用［J］．實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，29（4）：377－378．

［2］ 高峰．臨床輸血與檢驗(yàn)［M］．2版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：70－72．

［3］ 劉開良，李寧，李碧娟，等．患者紅細(xì)胞不規(guī)則同種抗體分析與臨床意義的探討［J］．中國(guó)輸血雜志，2011，24（9）：787－789．

［4］ 楊世明，張勇萍，安寧，等．新生兒溶血病紅細(xì)胞血型免疫性抗體的特異性分析［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（10）：1130－1131．

［5］ 王玲．部分人群中Rh血型C、E抗原分布及意義［J］．臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28（5）：371．

［6］ 岳曉紅．IgG類抗-E致新生兒溶血病4例分析［J］．臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28（3）：209－214．

R457．11

B

1671－7783（2014）06－0520－02

10．13312／j．issn．1671-7783．y140191

鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（SH2013098）

*：通訊作者，E-mail：yangquanzhu＠aliyun．com

2014－07－08 ［編輯］ 何承志