趙琪

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇無(wú)錫214023）

一步法宮頸脫落細(xì)胞人乳頭瘤病毒DNA抽提方法的建立

趙琪

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇無(wú)錫214023）

目的：建立一步法抽提宮頸脫落細(xì)胞人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA的方法。方法：收集200例宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，分別采用柱式法DNA提取試劑盒和一步法抽提HPV-DNA，用微量核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA的純度和濃度，采用PCR反向斑點(diǎn)雜交（PCR-RDB）法進(jìn)行HPV-DNA分型檢測(cè)。結(jié)果：柱式法抽提的DNA純度和濃度分別為（1．91±0．14）μg／mL和（139．78±18．21）μg／mL，一步法抽提的DNA純度和濃度分別為（1．86±0．19）μg／mL和（124．36±17．35）μg／mL，兩種方法的DNA純度和濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。柱式法和一步法HPV分型的總陽(yáng)性率、單一感染率、多重感染率分別為17．5%（35／200）、7．5%（15／200）、10%（20／200）和17．5%（35／200）、8%（16／200）、9．5%（19／200），兩法一致性檢驗(yàn)Kappa值為0．886，結(jié)果具有較好的一致性。結(jié)論：一步法提取宮頸脫落細(xì)胞HPV-DNA步驟簡(jiǎn)單，DNA質(zhì)量高，完全適用于臨床樣本的HPV分型檢測(cè)。

聚合酶鏈反應(yīng)；反向斑點(diǎn)雜交；人乳頭瘤病毒；DNA提?。灰徊椒?；分離方法

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種嚴(yán)格嗜上皮細(xì)胞的病毒，HPV感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）有關(guān)，高危型別HPV是許多生殖道疾病或生殖道癌癥的致病原因之一［1－2］。HPV分型檢測(cè)作為臨床預(yù)測(cè)患病風(fēng)險(xiǎn)、選擇治療方案和HPV疫苗開(kāi)發(fā)研究的重要指標(biāo)，日益受到重視。HPV-DNA提取方法的研究是對(duì)其基因型檢測(cè)的基礎(chǔ)和前提，提取的DNA質(zhì)量也直接影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。目前，HPV在臨床上的應(yīng)用除了受到分型方法繁瑣和成本昂貴等因素限制之外，HPV-DNA提取過(guò)程過(guò)于復(fù)雜也限制臨床上廣泛使用。為了減少工作強(qiáng)度和提高DNA質(zhì)量，建立一種操作簡(jiǎn)單，成本低廉，質(zhì)量符合PCR擴(kuò)增需要的HPV-DNA提取方法顯得特別重要。本研究建立了一步法HPV-DNA提取法，并與柱式法DNA提取法相比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本

收集200例2013年5月至12月來(lái)本院體檢的女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，其中正常狀態(tài)標(biāo)本（不帶血液和黏液、外觀清亮）60例，帶血標(biāo)本（外觀紅色或紅褐色）40例，帶黏液標(biāo)本（外觀混濁、膠凍狀）50例，帶血帶黏液標(biāo)本（外觀紅色或紅褐色、膠凍狀）50例。每份樣本混勻后平均分為2管，每管各吸取500μL宮頸液。根據(jù)隨機(jī)分配原則，一管標(biāo)本采用柱式法DNA提取試劑盒抽提HPV-DNA，另外一管則采用一步法進(jìn)行HPV-DNA抽提。

1．2 主要儀器和試劑

Verriti96孔梯度PCR儀（美國(guó)ABI公司），Thermo臺(tái)式微量離心機(jī)，NV3000C核酸測(cè)定儀（美國(guó)），Bioer恒溫金屬浴，亞能YN-H16雜交儀，TY-80R脫色搖床。

本研究所用引物和探針由上海英駿生物公司合成。多重PCR試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，柱式法DNA提取試劑盒、TMB購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；A、B、C液和一步法HPVDNA提取液為本室自配，PCR反向斑點(diǎn)雜交（PCR reverse dot blot，PCR-RDB）法HPV分型試劑由本室研制。

1．3 方法

1．3．1 DNA提取 ①一步法HPV-DNA提取步驟：在含宮頸脫落細(xì)胞的1．5 mL離心管中加入1 mL雙蒸水，劇烈振蕩（3 000 r／min）10 min（正常狀態(tài)標(biāo)本可省略此步），13 000 r／min離心5 min，棄上清（帶血樣本重復(fù)1次）。在細(xì)胞沉淀中加入一步法HPV-DNA提取液100μL。充分混勻，100℃煮沸10 min。13 000 r／min離心5 min，上清備用。②柱式法提取HPV-DNA按說(shuō)明書操作。分別取2μL兩種方法提取的HPV-DNA用微量核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA純度和濃度。

1．3．2 PCR體系及擴(kuò)增 將上下游引物稀釋至100μmol／L后各取5μL混勻分別配成上下游混合引物。50μL多重PCR擴(kuò)增體系中包含25μL Qiagen緩沖液，5μLQ-溶液，5μL染料，0．157 5μL的上游引物和0．362 5μL的下游引物，模板4μL，水10．48μL。95℃預(yù)變性10min；95℃30 s，50℃90 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。

1．3．3 雜交 HPV PCR-RDB分型方法簡(jiǎn)述如下：取20μL PCR產(chǎn)物加入含8 mL A液的雜交管中，100℃變性10 min。放入雜交儀中51℃雜交2 h。取出膜條，放入預(yù)熱至51℃裝有B液的雜交管中，51℃搖洗5 min。取出膜條，放入用 A液1∶2 500稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素中，室溫輕搖孵育30 min。A液室溫洗滌2次，每次5 min。C液洗滌膜條2 min，避光顯色3 min，蒸餾水終止反應(yīng)。膜條相應(yīng)位置出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的藍(lán)色斑點(diǎn)判斷為某型別HPV陽(yáng)性，用β-球蛋白基因作為內(nèi)控（IC）。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組樣本的DNA純度、濃度進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)。一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0．75表明兩者一致性好，0．75＞Kappa值≥0．4表明一致性一般，Kappa值＜0．4表明兩者一致性差。

2 結(jié)果

2．1 兩種提取方法所得HPV-DNA的濃度

柱式法與一步法抽提的DNA純度和濃度間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），見(jiàn)表1。

2．2 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，450 bp處出現(xiàn)條帶為陽(yáng)性，268 bp處出現(xiàn)條帶為β-球蛋白基因（圖1，只顯示部分結(jié)果）。

2．3 兩種HPV-DNA提取方法在HPV分型結(jié)果中的比較

200例臨床標(biāo)本HPV分型結(jié)果見(jiàn)表2，柱式法和一步法HPV分型的總陽(yáng)性率、單一感染率、多重感染率分別為17．5%（35／200）、7．5%（15／200）、10%（20／200）和17．5%（35／200）、8%（16／200）、9．5%（19／200），兩種方法在總陽(yáng)性率、單一感染率和多重感染率方面無(wú)明顯差異（χ2值分別為0，0．037和0．028，P值分別為1，0．847和0．866），兩法一致性檢驗(yàn)Kappa值為0．886（P＜0．01），結(jié)果具有良好的一致性。

3 討論

臨床HPV分型主要是基于PCR的分型法，是目前所有HPV-DNA分析技術(shù)中最敏感和方便的方法［3－4］。本研究采用的HPV方法是基于PCR的反向斑點(diǎn)雜交法。DNA提取是HPV檢測(cè)的基礎(chǔ)，提取純度及濃度將直接影響基于PCR的HPV分型方法的準(zhǔn)確性。D′Souza等［5］也指出，盡管是來(lái)源于同一組織的HPV標(biāo)本，前處理方法的不同也會(huì)導(dǎo)致HPV分型的差異。HPV病毒主要存在于宮頸上皮細(xì)胞，臨床上收集的標(biāo)本往往混雜有膿性黏液或血液。本研究的目的是建立一種簡(jiǎn)單實(shí)用的方法，能從不同狀態(tài)的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本中抽提出高質(zhì)量的DNA，用于PCR基礎(chǔ)的HPV分型檢測(cè)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

細(xì)胞基因組DNA提取方法有煮沸法、堿裂解法、SDS裂解法和蛋白酶K消化分離法等。煮沸法雖然操作方法簡(jiǎn)單，但細(xì)胞DNA收率較低，純度不高，同時(shí)內(nèi)源性抑制物不能有效清除，特別是帶血標(biāo)本。其他方法如堿裂解法、SDS裂解法和蛋白酶K消化分離法最后都需要飽和酚／氯仿的抽提過(guò)程，否則提取的DNA中的蛋白、EDTA和SDS等殘留物質(zhì)以及內(nèi)源性抑制物都會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生抑制作用，而飽和酚／氯仿的抽提過(guò)程十分煩瑣，大樣本量的臨床應(yīng)用受到限制。

柱式法采用硅膠膜作為核酸的特異性吸附材料，提取基本原理為飽和酚／氯仿的抽提加上核酸特異性吸附和洗脫。柱式法提取的核酸完整、純度高，提取的產(chǎn)物可直接用于PCR、RT-PCR及基因克隆等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究及臨床檢測(cè)。但是柱式法提取基因組DNA成本較高，操作雖然有所簡(jiǎn)化但還是相當(dāng)煩瑣，臨床應(yīng)用仍然受到限制。

標(biāo)本中的紅細(xì)胞可通過(guò)血紅素的卟啉環(huán)與Taq酶產(chǎn)生不可逆結(jié)合而抑制Taq酶的活性，導(dǎo)致PCR反應(yīng)受到抑制［6］。而黏液標(biāo)本中可能含有較多的黏蛋白、免疫球蛋白、蛋白酶和多糖等內(nèi)源性PCR抑制物，這些物質(zhì)可通過(guò)干擾核酸提取過(guò)程的細(xì)胞裂解或者通過(guò)抑制DNA聚合酶活性而干擾PCR反應(yīng)［7］。因此本研究共收集200例各種成分的宮頸脫落細(xì)胞樣本，包括正常狀態(tài)標(biāo)本、帶血標(biāo)本、帶黏液標(biāo)本和帶血帶黏液標(biāo)本，觀察一步法提取的DNA是否可以應(yīng)用于HPV分型。結(jié)果表明，本文建立的一步法在DNA提取純度和濃度方面與柱式法雖有明顯差異，但是260 nm／280 nm的比值達(dá)到了1．7～1．9的DNA提取要求，濃度足夠滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需要。PCR結(jié)果也證實(shí)一步法提取的DNA對(duì)擴(kuò)增無(wú)明顯抑制，說(shuō)明一步法提取的DNA中卟啉環(huán)以及一些內(nèi)源性PCR抑制物的濃度在不影響PCR結(jié)果的安全濃度之內(nèi)。分析其原因：①通過(guò)2次10 min的振蕩棄上清過(guò)程，帶血標(biāo)本中的血紅素卟啉環(huán)濃度大大降低，達(dá)到了臨床可接受的使用濃度。②通過(guò)10 min振蕩也使黏液標(biāo)本中的多糖等內(nèi)源性PCR抑制物大大減少。其他黏蛋白、免疫球蛋白和蛋白酶等蛋白類PCR抑制物則通過(guò)一步法提取液中的蛋白沉淀劑得到有效清除。

柱式法和一步法提取DNA后的HPV分型結(jié)果一致性檢驗(yàn)Kappa值達(dá)到0．886，顯示相關(guān)性良好，并且兩種方法總陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種方法的差異僅僅表現(xiàn)在1個(gè)標(biāo)本上，一步法的分型結(jié)果顯示是單重感染而柱式法顯示的是雙重感染。這進(jìn)一步說(shuō)明，一步法提取的DNA完全適合臨床樣本的HPV分型。

本研究建立的HPV-DNA一步提取法操作簡(jiǎn)單方便，全部操作時(shí)間：帶血標(biāo)本約45 min，帶黏液標(biāo)本約30 min，不帶血液和黏液標(biāo)本約20 min。這為大批量分析宮頸脫落細(xì)胞樣品（特別是黏液型和血液型標(biāo)本）的HPV分型，提供了一種簡(jiǎn)易的DNA提取手段。

總之，本研究建立的一步法提取宮頸細(xì)胞HPVDNA，效果類似于柱提法。并且一步法提取DNA有著不可代替的優(yōu)點(diǎn)：①大大減少了DNA提取的工作量，適合大樣本量的HPV分型檢測(cè)。②減少污染機(jī)會(huì)。較柱式法多次抽提換管而言，一步法提取DNA的整個(gè)操作在1個(gè)Ependorf管中進(jìn)行，減少了污染的概率。③降低了實(shí)驗(yàn)成本。

［1］ Chinchai T，Chansaenroj J，Swangvaree S，et al．Prevalence of human papillomavirus genotypes in cervical cancer［J］．Int JGynecol Cancer，2012，22（6）：1063－1068．

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［5］ D′souza G，Sugar E，Ruby W，et al．Analysis of the effect of DNA purification on detection of human papillomavirus in oral rinse samples by PCR［J］．JClin Microbiol，2005，43（11）：5526－5535．

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［7］ 李金明．實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)［M］．北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：70－71．

Establishment of the one-step DNA extraction method of human papillomavirus in cervical epithelium sam ples

ZHAO Qi
（Department of Clinical Laboratory，Wuxi People′s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi Jiangsu 214023，China）

Objective：To develop an one-step method on DNA extraction of human papillomavirus in cervical epithelium samples．M ethods：The extraction of HPV-DNA in 200 cases collected from cervical epithelium sampleswas treated by column method of DNA extraction kit or one-step method．DNA purity and concentration of the samples were measured by the trace nucleic acid spectrophotometer．HPV genotypeswere detected by PCR reverse dot blot（PCR-RDB）method．Results：DNA purity extracted by column method and one-step were（1．91±0．14）μg／mL and（1．86±0．19）μg／mL，respectively，and concentration of the HPV-DNA were（139．78±18．21）μg／mL and（124．36±17．35）μg／mL，respectively．DNA purity and concentration extracted by twomethodswere all not statistically significant（P＜0．01）．The rates of positive，single infection andmultiple infection of HPV genotyping treated by the columnmethod and one-step method were 17．5%（35／200），7．5%（15／200），10%（20／200）and 17．5%（35／200），8%（16／200），9．5%（19／200），respectively．The value of Kappa was0．886，which indicated that there was a high degree of consistency．Conclusion：The one-step method on HPV DNA extraction was simpler，the DNA quality was high and suitable for HPV DNA genotyping of the cervical epithelium samples．

polymerase chain reaction；reverse dot blot；human papillomavirus；DNA extraction；onestep method；separation method

Q781

A

1671－7783（2014）06－0491－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140261

趙琪（1971—），女，江蘇無(wú)錫人，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究。

2014－10－08 ［編輯］何承志