申偉霞，田巧珍，陳 圓，胡 濤，閆麗萍，李國新，李雪松，滕巧泱，趙宇軍，李澤君

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

H3、H9亞型禽流感病毒雙重熒光定量PCR方法的建立及初步應用

申偉霞1,2，田巧珍2，陳 圓2，胡 濤2，閆麗萍2，李國新2，李雪松2，滕巧泱2，趙宇軍1，李澤君2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

雖然H3、H9亞型禽流感病毒（Avian inf uenza virus, AIV）是低致病性禽流感病毒，但其具有跨宿主感染哺乳動物的能力，對社會公共衛(wèi)生安全具有重大的潛在危害，因而對這些亞型病毒的監(jiān)測極其重要。通過比對GenBank上H3、H9亞型禽流感病毒HA基因序列，設計了分別針對H3 AIV和H9 AIV的特異性探針。特異性試驗和標準曲線試驗的結(jié)果顯示，這兩個探針僅分別特異性識別H3、H9亞型AIV，且具有較好的擴增效率。通過重組質(zhì)粒pMD19-T-H3HA和pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀釋液為模板，進行敏感性實驗。結(jié)果表明，本研究所建立的熒光定量PCR方法能檢測到100個DNA拷貝數(shù)H3 AIV和10個DNA拷貝數(shù)的H9 AIV，比傳統(tǒng)PCR方法敏感性分別提高了100倍和1000倍。此外，本方法還能檢測到10 EID50的H3亞型AIV或H9亞型AIV，比傳統(tǒng)PCR方法檢測敏感性均提高了1000倍。批間和批內(nèi)試驗的變異系數(shù)均小于3%，表明本研究建立的方法具有較好的重復性。此外，與傳統(tǒng)PCR方法相比，用H3、H9亞型AIV雙重熒光定量PCR方法檢測人工感染動物的肺組織時，針對H3 AIV的敏感性提高了10～100倍，針對H9 AIV的敏感性提高了100倍。綜上所述，本研究所建立的H3、H9亞型禽流感病毒雙重熒光定量PCR方法具有較高的特異性和敏感性，對H3、H9亞型禽流感病毒監(jiān)測具有重要的應用價值。

H3；H9；禽流感病毒；熒光定量PCR

禽流感（avian influenza，AI）是由正粘病毒科A型流感病毒（Avian influenza virus，AIV）所引起的一種主要流行于雞群中的禽類高度接觸性傳染病。根據(jù)禽流感病毒致病性的不同，可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒[1]。據(jù)報道，H3、H4、H9、H10等亞型低致病性禽流感病毒均在我國流行[2]。我國自1994年首次報道雞群分離到H9N2亞型禽流感病毒以來[3]，H9亞型低致病性禽流感病毒廣泛存在于我國遼寧省、安徽省、山東省、廣東省、福建省、江蘇省、河南省、湖南省、湖北省、上海市、廣西壯族自治區(qū)、云南省、四川省、新疆維吾爾自治區(qū)等大部分地區(qū)[4]。低致病性的H9N2亞型禽流感病毒雖然不引起感染禽類的大量死亡，但是可導致感染禽產(chǎn)蛋下降和免疫抑制，與其他病原共感染時常導致高死亡率，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。H3亞型禽流感病毒是從野生鳥類和活禽市場分離到最常見的禽流感病毒之一[2,5]。此外，H3和H9亞型禽流感病毒皆獲得直接感染哺乳動物的能力[6-8]，對人類社會的公共衛(wèi)生安全具有極大的潛在威脅。

對于H3、H9等禽流感病毒傳統(tǒng)的檢測方法是首先通過接種雞胚分離病毒，然后再檢測雞胚尿囊液的血凝效價并做血凝抑制實驗檢測。這種方法具有準確、敏感、可重復的優(yōu)點，但是耗時長和費精力，不能滿足疾病快速方便檢測的需要。另外，禽流感病毒也可以通過傳統(tǒng)PCR方法來檢測，但其有一定的局限性，不能同時檢測出幾種亞型禽流感，同時傳統(tǒng)PCR敏感性不高，容易出現(xiàn)漏檢。本研究選擇一種具有準確性高、敏感性高、快速、便捷的熒光定量PCR方法用于鑒別診斷H3和H9亞型禽流感病毒，并在人工感染動物的樣品檢測中進行了初步應用，取得了較好的效果。因此，本研究所建立的H3、H9亞型禽流感病毒雙重熒光定量PCR方法具有很高的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 主要材料毒株：H3、H4、H6、H9、H10、H11等亞型禽流感病毒，雞新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）和鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus, DTMUV）皆保存于本實驗室，具體如下：A/Duck/Shanghai/68/2009（H3N2）（簡稱為SH68）、A/Duck/Shanghai/28-1/2009（H4N2）、A/Chicken/Guangdong/1268/2010（H6N2）、A/Chicken/Shanghai/441/2009（H9N2）（簡稱為SH441）、A/Chicken/Shanghai/602/2009（H10N2）、A/Chicken/Nanjing/908/2009（H11N2）、疫苗株Lasota、A/Chicken/Nanjing/977/2009（NDV）、鴨坦布蘇病毒(FX2010株)等病毒株。 試劑：RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司； M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease inhibitor、10 mmol/L dNTP mix、Premix ExTaq、pMD19-T載體、JM109感受態(tài)細胞購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司。

1.2 引物和探針的設計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的H3亞型和H9亞型禽流感病毒株HA基因保守核苷酸序列，用DNAStar軟件進行同源性分析，通過Primer 5.0軟件設計H3亞型和H9亞型禽流感病毒對應的兩對引物和探針（表1）。上述引物和探針由上?；瞪锛夹g有限公司合成。

表1 H3亞型和H9亞型禽流感病毒熒光定量PCR檢測所用的引物Table 1 The primers for f uoresendetection of H3 subtype and H9 subtype Avian inf uenza virus

1.3 提取RNA并合成cDNA根據(jù)Trizol LS Reagent使用說明書進行病毒RNA的抽提。用20 μL DEPC水溶解提取的RNA ，然后按M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應體系為20 μL：總RNA模板10 μL，12 bp引物2 μL，吹吸混勻，瞬時離心放于70 ℃孵育10 min，水溶2 min以上；之后加入以下試劑：5×Reverse Transcriptase M-MLV buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mixture 2 μL、Ribonuclease inhibitor（40 U/μL）0.5 μL、RNase M-MLV （200 U/μL）1 μL。30 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育10 min。反應完成后，cDNA放于－20 ℃保存。

1.4 熒光定量PCR熒光定量PCR的體系為25 μL：超純水 5.5 μL、Premix ExTaq12.5 μL、H3-NED 0.5 μL、H3-AIVF 1 μL、H3-AIVR 1μL、H9-FAM 0.5 μL、H9-AIVF 1 μL、H9-AIVR 1 μL、模板2 μL。PCR程序：95 ℃ 預變性2 min；95 ℃ 變性15 s、60 ℃退火 34 s，共40個循環(huán)。

1.5 常規(guī)PCR擴增H3 AIV常規(guī)PCR的體系為25 μL：超純水 9.5 μL、PCR Mix 12.5 μL、H3HA-1F 1μL、H3HA-1319R 1 μL、模板 2 μL。 H9 AIV常規(guī)PCR的體系為25 μL：超純水 9.5μL、PCR Mix 12.5μL、H9HA-151F 1μL、H9HA-638R 1μL、模板 2μL。PCR程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃ 變性30 s、53 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

1.6 標準質(zhì)粒的構(gòu)建及標準曲線將H3N2亞型禽流感病毒SH68、H9亞型禽流感病毒SH441抽提RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)A型流感病毒HA的通用引物SapI-HA-F （CACACAgctcttctattAGCAAAAGCAG GGG）和SapI-HA-R（CACACAgctcttcggccAGTA GAAACAAGGGTGTTTT），以上述cDNA為模板擴增H3亞型和H9亞型禽流感病毒的 HA基因的全片段，擴增程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性 30 s、53 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。電泳鑒定擴增的HA基因割膠純化，分別連接到pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化于JM109感受態(tài)細胞。

疑似陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定陽性后送invitrogen公司測序。該重組質(zhì)粒分別命名為pMD19 -T-H3HA和 pMD19-T-H9HA。質(zhì)粒抽提試劑盒說明書，將pMD19-T-H3HA菌液、pMD19-T-H9HA菌液抽提質(zhì)粒。通過EPOCH（BioTek公司）儀器測定質(zhì)粒濃度，計算DNA拷貝數(shù)，并分裝存放于－20 ℃。

將pMD19-T-H3HA質(zhì)粒和pMD19-T-H9HA質(zhì)粒以10倍梯度稀釋的標準品為模板，在ABI的7500熒光定量PCR儀上進行檢測，獲得模板拷貝數(shù)與臨界循環(huán)數(shù)（threshold cycle，Ct）的標準曲線。

1.7 敏感性試驗

1.7.1 DNA拷貝數(shù)敏感性 將pMD19-T-H3HA質(zhì)粒和pMD19-T-H9HA質(zhì)粒以10倍梯度稀釋的標準品為模板，在ABI的7500熒光定量PCR儀上進行檢測。通過不同濃度標準品的Ct值，判定該方法所能檢測的最小DNA拷貝數(shù)量。以這些梯度稀釋的質(zhì)粒為模板，用H9HA-F、H9HA-R和H3HA-F、H3HA-R為引物(表1)，進行傳統(tǒng)PCR方法來分別檢測H9亞型、H3亞型禽流感病毒。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳來鑒定。1.7.2 病毒滴度（EID50）敏感性 將H3N2亞型禽流感病毒SH68 (106.5EID50/100 μL)、H9N2亞型禽流感病毒SH441 (107.0EID50/100 μL)，用Trizol法抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。10倍梯度稀釋的cDNA為模板，用熒光定量PCR的方法檢測，并記錄Ct值。同樣，以這些梯度稀釋的cDNA為模板，用H9HA-F、H9HA-R和H3HA-F、H3HA-R為引物，進行傳統(tǒng)的PCR方法檢測。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳來鑒定。

1.8 特異性試驗分別以H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11亞型禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒和雞新城疫病毒 的cDNA為模板，進行熒光定量PCR檢測。

1.9 批內(nèi)和批間試驗為了測定熒光定量PCR方法的重復性，以3個不同濃度的pMD19-T-H3HA或pMD19-T-H9HA質(zhì)粒為模板（1×107、1×106、1×105拷貝數(shù)/μL）。批內(nèi)試驗的變異系數(shù)是由每個濃度質(zhì)粒重復5個孔測定的。批間試驗的變異系數(shù)是由每個濃度質(zhì)粒重復5次熒光定量PCR檢測而來。

1.10 動物實驗樣品的檢測將3周齡鴨滴鼻依次接種H9亞型禽流感病毒株SH441和H3亞型禽流感病毒株SH68, 劑量均為0.1 mL/只（106EID50），每個毒株接種3只鴨（n=3），并設立正常對照組，滴鼻接種PBS 0.1 mL/只。每天觀察其臨床癥狀，并于攻毒后第3日取所有鴨（包括攻毒組和正常對照組），采集肺。每個組織樣品加1 mL PBS，10 800×g離心。取0.1 mL上清接9～11日齡SPF雞胚，72 h取尿囊液，進行血凝試驗；另一部分上清抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以10倍系列稀釋的cDNA為模板，分別用熒光定量PCR和常規(guī)PCR方法檢測。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線以10倍梯度稀釋的pMD19-T-H3HA質(zhì)粒和pMD19-T-H9HA質(zhì)粒的混合物為模板進行熒光定量PCR擴增，根據(jù)DNA拷貝數(shù)和Ct值繪制標準曲線。結(jié)果如圖1所示，本方法H3亞型禽流感的擴增效率為0.98，且標準曲線的R2值為0.996，接近1；H9亞型禽流感的擴增效率為0.98，且標準曲線的R2值為0.998，接近1。產(chǎn)物的Ct值與濃度之間的線性關系非常好。

2.2 敏感性在本研究中，H3亞型禽流感病毒熒光定量PCR方法的DNA檢測敏感性可達到102個DNA拷貝數(shù)。常規(guī)PCR擴增結(jié)果顯示，該方法的敏感性只能達到104個DNA拷貝數(shù)（表2）。H9亞型禽流感病毒熒光定量PCR方法的DNA檢測敏感性可達到10個DNA拷貝數(shù)。常規(guī)PCR擴增結(jié)果顯示，該方法的敏感性只能達到104個DNA拷貝數(shù)（表2）。

抽取病毒尿囊液的RNA，以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增，記錄Ct值。結(jié)果如表3所示，用本研究的方法可以檢測到10 EID50的H3亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒 (表3)。同時，以cDNA為模板進行傳統(tǒng)的PCR方法檢測，結(jié)果顯示傳統(tǒng)PCR分別只能檢測到104EID50的H3亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒（表3）。

2.3 特異性以H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11亞型禽流感病毒及鴨坦布蘇和雞新城疫病毒cDNA為模板，進行熒光定量PCR方法檢測。結(jié)果如圖2所示，本研究所使用的Taqman探針能特異性地檢測H3亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒，但不能檢測H4、H6、H10和H11亞型禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒和雞新城疫病毒。

2.4 重復性3個不同濃度的質(zhì)粒pMD19-T-H3HA質(zhì)粒和3個不同濃度的質(zhì)粒pMD19-T-H9HA質(zhì)粒，按同一濃度混合并將混合物作為模板，進行熒光定量PCR。如表4所示，表明批內(nèi)試驗和批間試驗的變異系數(shù)均小于3%。本研究所建立的熒光定量PCR檢測方法具有很好的重復性。

圖1 熒光定量PCR的標準曲線Fig.1 The standard curve of f uorescence quantitative PCR

2.5 檢測動物實驗樣品及臨床樣品為了檢驗本研究所建立的熒光定量PCR檢測方法的實際應用效果，我們用該方法去檢測人工感染動物樣品。根據(jù)接雞胚的結(jié)果顯示，這些鴨子的肺組織均能檢測到目的病毒。檢測人工感染動物樣品的結(jié)果顯示，用熒光定量PCR檢測H9亞型禽流感病毒的敏感性比傳統(tǒng)PCR的方法提高100倍（表5），檢測H3亞型禽流感病毒的敏感性比傳統(tǒng)PCR的方法提高10～100倍（表6）。

3 討論

H9N2亞型禽流感流行廣泛，傳播速度快，可引起雛雞和育成雞的隱性感染和產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋下降且產(chǎn)蛋率難以恢復。H9N2亞型禽流感病毒本身對雞只的致死性較低，但一旦其與細菌等混合感染雞只，局面便無法控制。2011年冬天至2012年春天，我國的養(yǎng)雞業(yè)損失慘重，成功率不足50%，其罪魁禍首就是H9亞型禽流感。H3亞型禽流感病毒最初僅發(fā)現(xiàn)存在于水禽上，但慢慢也獲得了感染雞的能力[10]。最近，H3亞型AIV跨宿主傳播，獲得感染犬的能力，陸續(xù)在韓國及中國被報道[8,11]，可見H3亞型AIV已慢慢地獲得跨宿主傳播與感染的能力，對人類的安全有潛在的危險。因此，目前迫切需要建立一種快速診斷H3、H9亞型禽流感病毒的方法。本研究通過primer 5.0軟件，設計了特異的探針和引物。特異性實驗結(jié)果表明，該探針只特異性地識別H3、H9亞型禽流感病毒HA基因。此外，從擴增效率圖來看，該探針和引物的擴增效率較高，且DNA濃度與Ct值的線性關系好，方法可信度高。通過探針和引物所建立的熒光定量PCR法，整個過程僅耗時48 min。而傳統(tǒng)PCR方法，因為結(jié)果需要跑核酸電泳來檢測，所以整個過程至少需要3～3.5 h才能完成。用雞胚接種法檢測流感病毒準確，但耗時非常長，需3～4 d?？傊⒌腍3、H9亞型禽流感病毒雙重熒光定量PCR檢測方法，具有比常規(guī)方法更簡單、快速的特點。

表2 熒光定量 PCR 方法和傳統(tǒng) PCR DNA 敏感性的比較Table 2 The sensitive comparison between fluorescence quantitative PCR and conventional PCR

表3 病毒滴度敏感性檢測結(jié)果Table3 The detection sensitivity of virus titers

圖2 熒光定量PCR檢測的特異性Fig.2 The specif city of f uorescence quantitative PCR detection

表4 熒光定量PCR的批內(nèi)和批間檢測結(jié)果Table 4 The intra and inter dectection result of f uorescence quantitative PCR

表5 熒光定量PCR和傳統(tǒng)PCR法檢測H9 AIV感染鴨后的肺組織Table 5 The detection of lungs obtained from ducks infected with H9 AIV by f uorescence quantitative PCR and conventional PCR

表6 熒光定量PCR和傳統(tǒng)PCR法檢測H3 AIV感染鴨后的肺組織Table 6 The detection of lungs obtained from ducks infected with H3 AIV by f uorescence quantitative PCR and conventional PCR

目前，國內(nèi)外已有禽流感病毒H5、H7和H9亞型禽流感病毒熒光定量PCR檢測方法的相關報道[6-9]。在敏感性方面，本研究的熒光定量PCR方法檢測敏感性能達到10～100個DNA拷貝數(shù)，比普通的PCR方法檢測的DNA敏感性提高了100～1000倍。此外，本方法對H3或H9亞型禽流感病毒檢測的敏感性也能達到10 EID50，比普通PCR方法檢測的EID50敏感性提高了1000倍。批內(nèi)、間試驗結(jié)果也表明，H3、H9亞型禽流感病毒雙重熒光定量PCR法具有較好的重復性。

利用建立的熒光定量PCR法，對人工感染的實驗動物樣品進行檢測。結(jié)果表明，本研究所建立的熒光定量PCR法在檢測肺的樣品時，檢測的敏感性較傳統(tǒng)PCR的方法提高了10～100倍。

總之，本研究所建立的H3、H9亞型禽流感病毒熒光定量PCR檢測方法，具有較好的準確性、特異性和敏感性，可很好地應用于H3和H9亞型禽流感病毒的臨床檢測，對我國廣大地區(qū)H3、H9亞型禽流感疫病控制及其流行病學檢測具有積極的科學意義。

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DEVELOPMENT AND PRELIMINARY APPLICATION OF FLUORESCENT QUATITATIVE PCR ASSAY FOR DETECTION OF H3 AND H9 SUBTYPES OF AVIAN INFLUENZA VIRUS

SHEN Wei-xia1,2, TIAN Qiao-zhen2, CHEN Yuan2, HU Tao2, YAN Li-ping2, LI Guo-xin2, LI Xue-song2, TENG Qiao-yang2, ZHAO Yu-jun1, LI Ze-jun2
(1. College of animal science and technology, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China ; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Although H3 and H9 subtypes of Avian inf uenza virus (AIV) are low pathogenic in birds, they have adapted abilities to infect mammalians, which poses potential threat to human beings. Therefore, surveillance of H3 and H9 subtypes of AIV is important for publichealth. In the present study, TaqMan primers specif c for either H3 or H9 subtype were designed to develop f uorescent quantitative PCR (qPCR) by comparing the homology of HA gene sequences submitted on the GenBank. The specif city testing and amplif cation trials demonstrated that TaqMan primers only recognized their respective H3 or H9 subtype. The sensitivity testing of the assay was performed using 10 fold serial dilutions of pMD19-T-H3HA and pMD19-T-H9HA as templates. The result showed that qPCR was able to detect 100 DNA copies of H3 subtype or 10 DNA copies of H9 subtype, which was 100 fold or 1000 fold higher than conventional PCR. In addition, this assay was also able to detect 10 EID50of both H3 and H9 subtypes, which was 1000 fold higher than conventional PCR. The interand intra-assay trials demonstrated that the variations were less than 3% for both subtypes, indicating its good reproducibility. Moreover, qPCR was used to detect viruses in lung samples from experimentally infected chickens. As compared to conventional PCR, qPCR was 10-100 fold more sensitive for H3 subtype or 100 fold more sensitive for H9 subtype than conventional PCR. Therefore, qPCR method developed in this study showed high specif city and sensitivity and could be used for epidemiological study of H3 and H9 subtypes.

H3 subtype; H9 subtype; Avian inf uenza virus; f uorescent quantitative PCR

S852.659.5

A

1674-6422（2014）01-0016-09

2013-12-18

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2011AA10A200）；國家自然科學基金項目（31302115）；中央級公益性科研所基本科研業(yè)務費專項資金項目（2013JB06）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003012）；上海市科委現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領域重點科技攻關項目（12391902000）

申偉霞，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

李澤君，E-mail: lizejun@shvri.ac.cn；趙宇軍，E-mail: tgzhaoyujun@163.com；滕巧泱，E-mail: tengqy@shvri.ac.cn