馬 俊，張 超，曲新澤，樊虓翀，林逢生

（上海啟盛生物科技有限公司，上海 201203）

水貂綠膿桿菌的分離與鑒定

馬 俊，張 超，曲新澤，樊虓翀，林逢生

（上海啟盛生物科技有限公司，上海 201203）

2011～2013年間，從山東省、河北省和江蘇省等地的多個(gè)貂場(chǎng)疑似水貂出血性肺炎病貂的肺臟、肝臟和脾臟中分離到425株疑似綠膿桿菌。用綠膿桿菌的OprF和PEA基因的PCR引物對(duì)分離菌株的目的基因擴(kuò)增，經(jīng)核苷酸測(cè)序確定其均為綠膿桿菌序列。通過(guò)日本生研株式會(huì)社血清學(xué)分型系統(tǒng)進(jìn)行分型：G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%。取其中6株細(xì)菌（G血清型3株，其他血清型各1株）進(jìn)行詳細(xì)生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示該6株菌均符合綠膿桿菌的生化特性，并且從這6株中選4株細(xì)菌（每血清型各1株）腹腔接種小白鼠和氣管內(nèi)接種水貂，結(jié)果表明4株菌對(duì)其均有致病性。

出血性肺炎；綠膿桿菌；血清型；分離與鑒定

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）或稱銅綠假單胞菌是引起水貂出血性肺炎的病原體。水貂出血性肺炎是一種以出血性肺炎和敗血癥為主要特征的急性傳染病，發(fā)病急，死亡快，常呈地方性季節(jié)性暴發(fā)流行，發(fā)病貂場(chǎng)死亡率在10%～50%[1]，給養(yǎng)貂業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。1953年Knox等[2]在丹麥?zhǔn)状螆?bào)道了水貂出血性肺炎。該病在瑞典、芬蘭、美國(guó)、法國(guó)、日本等國(guó)均有報(bào)道。1984年，中國(guó)潘鐮生[3]首次報(bào)道了該病，此后陸續(xù)有發(fā)生[4-6]，近幾年來(lái)根據(jù)有關(guān)報(bào)道[7-8]和我們的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查結(jié)果表明，該病在各養(yǎng)貂省如山東省、吉林省、黑龍江省、河北省、內(nèi)蒙古自治區(qū)古相繼頻繁暴發(fā)。2011年9月，威海市榮成地區(qū)某貂場(chǎng)養(yǎng)殖1萬(wàn)只水貂，發(fā)生水貂出血性肺炎，共死亡1600 多只，病死率達(dá)到16%。2012年8月，濰坊諸城市某貂場(chǎng)養(yǎng)殖量為6000只，8月份時(shí)出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、死前口鼻出血等呼吸道癥狀，持續(xù)死亡達(dá)十多天，每天死亡10多只，高峰期可達(dá)60只，死亡率達(dá)22%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2012 年10月，文登市宋村鎮(zhèn)某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生水貂出血性肺炎，死亡率高達(dá)35%。引起水貂出血性肺炎的綠膿桿菌血清型很多，不同血清型之間幾乎沒(méi)有交叉免疫保護(hù)，并且對(duì)抗生素的耐藥性強(qiáng)，給水貂出血性肺炎的防治工作帶來(lái)很多的困難。

本實(shí)驗(yàn)室在2011～2013年間，從山東省、河北省和江蘇省等地的病貂肺臟、肝臟、脾臟中分離了425株綠膿桿菌，進(jìn)行了分子生物學(xué)和生化特性鑒定、血清學(xué)分型及動(dòng)物感染試驗(yàn)的系統(tǒng)研究，并且首次在國(guó)內(nèi)分離到水貂綠膿桿菌E血清型菌株，為我國(guó)水貂出血性肺炎防治研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病料采集自山東省即墨市、海陽(yáng)市、榮成市、文登市、諸城市、河北省昌黎縣、唐山市樂(lè)亭縣和江蘇省連云港市等地的貂場(chǎng)；PCR所用陽(yáng)性對(duì)照雞綠膿桿菌菌株為揚(yáng)州大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；微量生化反應(yīng)鑒定管（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司）；綠膿桿菌血清分型用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（日本生研株式會(huì)社）；溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、牛肉浸出粉3 g、溴化十六烷基三甲胺0.3 g、瓊脂14 g，調(diào)整pH為7.5，121 ℃滅菌20 min；ICR小鼠：SPF級(jí)、雌性、體重約20 g、約5周齡，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；水貂：健康黑色標(biāo)準(zhǔn)貂、雌性、年齡約4個(gè)月齡，購(gòu)自上海市南匯區(qū)某貂場(chǎng)。

1.2 細(xì)菌分離打開患疑似出血性肺炎病貂的胸腔和腹腔，無(wú)菌采集肺臟、肝臟、脾臟病料接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，對(duì)生長(zhǎng)的疑似菌落連續(xù)傳代進(jìn)行革蘭氏染色及形態(tài)觀察。

1.3 分子生物學(xué)鑒定綠膿桿菌的外毒素A（PEA）是重要的致病因子；外膜蛋白F（OprF）是綠膿桿菌的最重要外膜蛋白之一，抗F蛋白抗體對(duì)綠膿桿菌具有高度的特異性，與免疫保護(hù)有關(guān)[9-14]。所以我們根據(jù)GenBank提交的序列（GenBank登錄號(hào): NC_002516.2）設(shè)計(jì)了針對(duì)PEA和OprF的兩對(duì)引物以對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。煮沸法制備細(xì)菌PCR模板，利用PCR擴(kuò)增綠膿桿菌的PEA基因和OprF基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

擴(kuò)增PCR程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物加在含有5 μg/mL EB的1%瓊脂糖凝膠中，以標(biāo)準(zhǔn)100 bp DNA Marker作為參考，100 V電泳40 min，在凝膠成像儀上觀察。有特異性條帶，切膠，按照DNA純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行膠回收，送到生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 用于擴(kuò)增OprF和PEA基因的引物序列Table 1 Sequences of the primers used to amply OprF and PEA genes

1.4 血清學(xué)鑒定用玻板凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型分型。按日本生研株式會(huì)社的綠膿桿菌血清學(xué)分型試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作：將待檢測(cè)菌株單菌落接種于溴化十六烷基三甲胺液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，離心重懸后取一滴與30 μL分型血清進(jìn)行混合，同時(shí)設(shè)抗原與生理鹽水反應(yīng)作為陰性對(duì)照組。充分混合后，1 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.5 生物學(xué)特性經(jīng)過(guò)血清學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后，從中挑取6株待檢菌株（M02、M06和MJM1株為G型，M03株為B型，M12株為C型，M13株為E型）單菌落，接種生化反應(yīng)管進(jìn)行生化項(xiàng)目測(cè)定，生化反應(yīng)條件按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 致病性試驗(yàn)G、B、C、E四種血清型各挑選一株（MJM1、M03、M12和M13株）進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)。

1.6.1 小鼠致病性試驗(yàn) 取25只小鼠，隨機(jī)分為5組，每組5只，第1～4組為攻毒組。上述4種血清型菌株的16 h培養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋后，分別腹腔接種第1～4組小鼠，0.5 mL/只，同時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；第5組為對(duì)照組，腹腔接種細(xì)菌培養(yǎng)基，0.5 mL/只。攻毒后連續(xù)觀察5日，記錄小鼠的臨床癥狀和死亡情況。

1.6.2 水貂致病性試驗(yàn) 上述4種血清型菌株在37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，原液做10倍系列稀釋作為水貂接種物，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。取82只約4月齡健康母貂，隨機(jī)分為17組，其中第1～16組，每組5只，剩余1組（第17組）2只作為對(duì)照。每株菌接種4組水貂，分別氣管內(nèi)接種100、10-1、10-2、10-3的稀釋菌液，0.5 mL/只；對(duì)照組，氣管內(nèi)接種細(xì)菌培養(yǎng)基，0.5 mL/只。攻毒后連續(xù)觀察5日，記錄水貂的臨床癥狀和死亡情況，用Reed- Muench法計(jì)算每種菌對(duì)水貂的LD50。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和培養(yǎng)特性將貂場(chǎng)采集的病料劃線接種于選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。若在培養(yǎng)基上菌落呈微隆起或扁平狀向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面光滑濕潤(rùn)，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性綠色或褐色色素，經(jīng)革蘭氏染色為陰性，呈兩端鈍圓的桿菌，單個(gè)或成雙排列的分離菌，初步判定為綠膿桿菌，共425株。普通平板上菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果分別見圖1和圖2。

圖1 綠膿桿菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Pseudomonas aeruginosa

圖2 綠膿桿菌革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of Pseudomonas aeruginosa

2.2 分子生物學(xué)鑒定分離的425株菌，OprF引物擴(kuò)增的目的條帶大小約為1400 bp，PEA引物擴(kuò)增的目的條帶大小約1600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，M03（B血清型）、M06（G血清型）、M12（C血清型）和M13（E血清型）的PCR結(jié)果見圖3。PCR片段經(jīng)序列分析比對(duì)，結(jié)果表明以上2.1初步判定為綠膿桿菌的425株確實(shí)為綠膿桿菌菌株。

圖3 4種血清型綠膿桿菌PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplif cations of Pseudomonas aeruginosa of 4 serotypes

2.3 血清學(xué)鑒定依照日本生研說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)，若待檢菌液與特異血清反應(yīng)出現(xiàn)凝集塊，且生理鹽水空白對(duì)照不凝集者為陽(yáng)性，沒(méi)有凝集則為陰性。結(jié)果顯示所分離的425株綠膿桿菌均能與G型或B型或C型或E型抗血清發(fā)生凝集，其中G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%。從分離到不同血清型菌株的臨床病料來(lái)源看，E型、C型菌株均與G型或B型菌株混合感染。

2.4 生化特性選取的6株細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果見表2，生化試驗(yàn)結(jié)果均符合綠膿桿菌的生化特性。

表2 選取的6株綠膿桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical test results of 6 pseudomonas aeruginosa isolates selected

2.5 致病性試驗(yàn)

2.5.1 小鼠的致病性 所有接種綠膿桿菌的小鼠在攻毒后24 h內(nèi)死亡，死亡率達(dá)100%，而對(duì)照組5只小鼠均健活，活菌計(jì)數(shù)得出各血清型綠膿桿菌菌株小鼠的攻毒劑量。MJM1（G型）：1.2×108cfu；M03（B型）：1.0×108cfu；M12（C型）：1.3×108cfu； M13（E型）：1.5×108cfu。

2.5.2 水貂的致病性 水貂氣管內(nèi)接種這4株菌后，發(fā)生了不同程度的死亡，而對(duì)照組水貂均健活，詳細(xì)情況見表3。用Reed-Muench方法計(jì)算MJM1、M03、M12和M13株綠膿桿菌的LD50分別為7.6×106、1.6×107、5.2×106和2.0×107cfu。

表3 4株綠膿桿菌對(duì)水貂的致病性和LD50測(cè)定Table 3 The pathogenicity of the 4 pseudomonas aeruginosa isolates in minks and determination of LD50

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室采用綠膿桿菌選擇培養(yǎng)基，從多個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)疑似水貂出血性肺炎的水貂內(nèi)臟中分離細(xì)菌。根據(jù)菌落形態(tài)、所產(chǎn)的色素、革蘭氏染色、OprF基因和PEA基因PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定對(duì)比，確定425株分離菌為綠膿桿菌。在此基礎(chǔ)上，采用日本生研株氏會(huì)社的血清分型系統(tǒng)對(duì)這425株細(xì)菌進(jìn)行了分型。其中G型376株，占88.5%；B型34株，占8%；C型12株，占2.8%；E型3株，占0.7%；水貂綠膿桿菌E血清型首次在我國(guó)報(bào)道。2011年白雪等[7]首次對(duì)分離的45株水貂綠膿桿菌進(jìn)行血清型分型（日本生研分型系統(tǒng)）：G 型42株（占93.4%）、B型2株（占4.4%）和I型1株（占2.2%），并報(bào)道，近10年來(lái)特產(chǎn)所從全國(guó)各地收集的67株水貂綠膿桿菌主要為G、B和C型，但沒(méi)有提到具體的百分?jǐn)?shù)，與歐洲和美國(guó)報(bào)道的主要流行血清型基本相同[1,7,8]。各報(bào)道中每個(gè)血清型的比例存在一定的差距，如Hammer等[1]報(bào)道在丹麥從1998至2001年期間74個(gè)水貂場(chǎng)發(fā)生的出血性肺炎病料中，分離到的168株綠膿桿菌中，G型117株，占69.6%；B型21株，占12.5%；C型30株，占17.8%。本實(shí)驗(yàn)室分離出的C型和E型菌株均是從G型或B型菌株感染的病例中分離到的，是混合感染，并且在同一臨床樣品中，G型或B型菌株是占絕對(duì)多數(shù)；并且，從菌落形態(tài)、所產(chǎn)的色素、革蘭氏染色結(jié)果很難區(qū)分不同的血清型菌株，這可能導(dǎo)致C型、E型菌株分離率較低。

根據(jù)發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道，水貂綠膿桿菌同一血清型的不同菌株或同一菌株對(duì)水貂和小鼠的致病性有所不同。本試驗(yàn)選取的4株（G、B、C和E血清型各1株）對(duì)小鼠和水貂均有致病性，并且通過(guò)水貂氣管內(nèi)接種各血清型菌株，得出各血清型菌株對(duì)水貂半數(shù)致死量（LD50）沒(méi)有很大的差別（少于5倍量），說(shuō)明各血清型的綠膿桿菌均存在對(duì)水貂毒力強(qiáng)的菌株。

近年來(lái)，水貂出血性肺炎發(fā)生頻率逐年上升，已成為水貂養(yǎng)殖業(yè)的大病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失。同時(shí)，水貂出血性肺炎臨床流行現(xiàn)狀也出現(xiàn)了新趨勢(shì)，發(fā)病區(qū)域由沿海地區(qū)向內(nèi)地蔓延，以前集中在大連市、山東省沿海等地，近來(lái)在河北、吉林省等內(nèi)陸地區(qū)發(fā)病日益增多；發(fā)病高峰期變長(zhǎng)，以往集中在8、9月份，現(xiàn)在6月初即有綠膿桿菌導(dǎo)致的出血性肺炎發(fā)生，7～10月都是該病發(fā)病高峰期。已有的文獻(xiàn)報(bào)道和我們的試驗(yàn)結(jié)果（沒(méi)有發(fā)表）表明G、B、C和E血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù)或交叉保護(hù)力很低，故疫苗包含的血清型最好能涵蓋所有流行血清型，國(guó)外這4個(gè)血清型的多價(jià)苗在市場(chǎng)上已應(yīng)用多年，國(guó)內(nèi)研發(fā)出能夠保護(hù)所有流行血清型的多價(jià)疫苗是目前預(yù)防該病的一個(gè)重要研究方向。綠膿桿菌引起的出血性肺炎發(fā)病急、死亡迅速，發(fā)現(xiàn)發(fā)病時(shí)往往來(lái)不及投藥治療，所以采取預(yù)防加治療的方式，可以有效的減少發(fā)病概率和經(jīng)濟(jì)損失。由于在臨床生產(chǎn)中抗生素的不合理使用，綠膿桿菌已對(duì)大部分抗生素產(chǎn)生了耐藥性，故一旦發(fā)現(xiàn)疫情后，需充分利用臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇合理的敏感抗生素進(jìn)行交叉投喂，并大群緊急接種多價(jià)疫苗，可有效的控制病情，減少損失。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PSEUDOMONAS AEROGINOSA OF MINKS

MA Jun, ZHANG Chao, QU Xin-ze, FAN Xiao-chong, LIN Feng-sheng
(Shanghai Qisheng Biotechnology Co. Ltd, Shanghai 201203, China)

Total 425 isolates of suspectedPseudomonas aeroginosawere isolated from 2011 to 2013 from lungs, spleens and livers collected during breakouts of hemorrhagic pneumonia on mink farms in Shandong, Hebei and Jiangsu provinces. Two pairs of PCR primers were designed based on sequences of OprF and PEA genes, respectively. The DNA templates were extracted from these 425 isolates and amplif ed in PCR using the primer sets. The sizes of PCR products and nucleotide sequences conf rmed that all 425 isolates were minkPseudomonas aeroginosa. Serological typing divided these isolates into 4 serotypes: 376 (88.5%) isolates in G serotype, 34 isolates (8.0%) in B serotype, 12 isolates (2.8%) in C serotype and 3 isolates (0.7%) in E serotype. Six isolates (3 from G serotype and one from each of other 3 serotypes) were randomly selected for further biochemical tests. All of these 6 isolates met requirements forPseudomonas aeroginosa. In addition, 4 out of these 6 isolates (one serotype each) were inoculated into mice and minks and caused all animals sick.

Hemorrhagic pneumonia;Pseudomonas aeroginosa; serotype; isolation and identif cation

S852.614

A

1674-6422（2014）01-0044-06

2013-11-17

馬俊，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

林逢生，E-mail：linfengsheng@bioqy.com