徐文財，劉 秋，李 旦，胡序明,，吳庚華，錢 琨,,3，邵紅霞,,3，金文杰,,3，秦愛建,,3

（1.揚州大學教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；2.揚州 大學江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

雞β2-微球蛋白的基因克隆與原核表達

徐文財1，劉 秋1，李 旦1，胡序明1,2，吳庚華2，錢 琨1,2,3，邵紅霞1,2,3，金文杰1,2,3，秦愛建1,2,3

（1.揚州大學教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；2.揚州 大學江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

本研究通過RT-PCR從正常雞外周血淋巴細胞總RNA中擴增chβ2m 基因全長片段，然后將其克隆至原核表達載體pET-32a（+），轉化大腸桿菌BL21（DE3），用IPTG對其進行誘導表達，利用HiTrap親和柱對表達產物進行純化。結果顯示，采用RT-PCR擴增出chβ2m基因全長約360 bp，編碼120個氨基酸，與基因庫公布的相一致，同源性為100%；經0.8 mM IPTG誘導表達后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于細菌裂解上清；利用His標簽純化該蛋白，SDS-PAGE分析僅見約34 kDa大小的chβ2m融合蛋白條帶；Western-blot分析表明，純化后的chβ2m融合蛋白與特異單克隆抗體反應呈現(xiàn)特異性的條帶。以上結果證實，本研究成功表達并獲得了純化的可溶性chβ2m融合蛋白，為進一步對chβ2m結構及其功能研究奠定基礎。

β2-微球蛋白；基因克??；原核表達

β2-微球蛋白（β2-microglobuli, β2m）由Berggard[1]于1968年首先從腎小管病變患者的蛋白尿中分離出來。β2m是由99個氨基酸殘基組成的小分子量非糖基化蛋白，約12 kDa[2]。所有有核細胞均能合成[3]，β2m作為主要相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）I類分子的β鏈（輕鏈），對維持MHC-I類分子天然構型的穩(wěn)定及執(zhí)行正常的生理功能具有重要作用[4]。最近研究人員發(fā)現(xiàn)在人類腎癌、前列腺、骨髓癌等癌癥惡化過程中，β2m往往過表達[5,6]。在禽類研究方面，本實驗室對感染馬立克氏病病毒的SPF雞皮膚蛋白質組差異表達的研究發(fā)現(xiàn)，β2m顯著升高[7]，并且認為其可作為腫瘤發(fā)展的重要標志。

雞不僅可作為小動物腫瘤研究模型，并且其免疫反應，抗病性以及疫苗反應性均可為人類疾病控制與免疫調節(jié)奠定良好的基礎[8]，目前，關于雞MHC-I尤其是對雞β2m（chicken β2-microglobuli, chβ2m）研究至今仍然很少。因此，我們構建了能高效表達chβ2m的原核表達載體，并利用該系統(tǒng)表達并純化得到大量可溶性chβ2m融合蛋白，為chβ2m的結構及其生物學功能的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株與實驗動物大腸桿菌DH5α和原核表達宿主菌BL21（DE3）均由本室保存；pGEM-T Easy 載體購自Promega公司；pET-32a（+）原核表達載體購自Clontech 公司。

1.2 主要試劑和儀器淋巴細胞分離液購自Sigma公司；DNA Marker、LATaq聚合酶和反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；EcoR ?、Xho?等限制性內切酶購自Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒和總RNA提取試劑盒購自Axygen公司；HiTrap親和柱購自GE公司；AP標記的羊抗鼠IgG二抗購自Sigma-Aldrich公司；BCIP/NBT Solution購自Amresco公司；LB培養(yǎng)基、2×YT培養(yǎng)基由本室配制；抗His標簽蛋白單克隆抗體由本室制備并保存；其他試劑均為國產或進口分析純；蛋白電泳儀，PTC-100 PCR儀，PAC200電泳儀均為BIO-RAD公司產品；4 ℃冷凍離心機為Eppendorf公司產品；制冰機AF100AS為Scotsman公司產品；MiniLumi凝膠成像系統(tǒng)為DNR公司產品。

1.3 PCR引物的設計與合成根據(jù)已公布的雞β2-微球蛋白（GenBank: AY989898、Z48921）設計引物用于擴增含信號肽的chβ2m CDS全長序列。上游引物P1：5'-TTGAATTCATGGG GAAGGCGGCGGC-3'；下游引物P2：5'-TTCTCGA GTCAGAACTCGGGATCCCA-3'。上游引物與下游引物中分別加入了EcoR I 和XhoI 酶切位點，引物由上海英駿生物工程公司合成。

1.4 雞外周血淋巴細胞的分離無菌采取28日齡正常雞外周血2 mL，注入含有肝素的無菌采血管中（每毫升全血含0.1 mL 肝素，即1:10稀釋），立即上下緩慢顛倒混勻，使血液抗凝；然后將抗凝血移入10 mL玻璃離心管，用吸管加入等量PBS （pH=7.2），使血液等倍稀釋；再吸取淋巴細胞分離液2 mL置于10 mL玻璃離心管中，將上述稀釋的血液在距分離液界面上1 cm處沿試管壁緩慢加至分離液表面，3000×g離心15 min，離心后，管內分層。最后用200 μL移液槍輕輕插入灰白色淋巴細胞層，輕輕吸出該層淋巴細胞，然后將其轉入另一個10 mL離心管中，用5倍體積的PBS洗滌細胞2次，每次以2000 ×g離心10 min，棄上清，離心下的細胞即為雞外周血淋巴細胞。

1.5 總RNA的提取和cDNA的合成雞外周血淋巴細胞總RNA的提取按照Axygen小提RNA試劑盒操作說明進行，總RNA反轉錄為cDNA按PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒操作說明進行。

1.6 chβ2m基因擴增與鑒定以設計合成的chβ2m特異性引物（P1/P2）為引物，以轉錄的雞外周血淋巴細胞cDNA為模板，進行PCR擴增chβ2m基因，反應體系為：5×PCR Buffer（含MgCl2）10 μL，dNTP 8 μL，LATaqDNA 0.5 μL，模板 1 μL，上下游引物各1 μL（20 umol/L）。然后按95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 1 min，56 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結束后用1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.7 重組質粒pGEM-T-chβ2m的構建將擴增出的chβ2m目的條帶按照Axygen的AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進行回收純化與pMD18-T-easy Vector進行連接，轉化入DH5α感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，提取相應質粒進行酶切鑒定，將經鑒定為陽性重組質粒的克隆菌送上海英俊生物公司測序。

1.8 重組質粒pET-32a-chβ2m的構建將鑒定好的重組質粒pGEM-T-chβ2m，經EcoR ? 和Xho? 雙酶切后，回收約360 bp 大小的chβ2m目的片段，然后與經相同酶切的pET-32a空載體連接，轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布含Amp的 LB固體平板培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，提取相應質粒，然后用不同酶切位點進行酶切鑒定。

1.9 chβ2m的原核表達與純化將含有pET-32achβ2m原核表達載體的重組菌搖菌過夜培養(yǎng)，然后以1:100轉接種于含Amp的2YT培養(yǎng)基中，37 ℃ 225 rpm震蕩培養(yǎng)4 h；加入IPTG（使終濃度為0.4和0.8 mmol/L）后，28 ℃ 180 rpm誘導6 h；誘導表達后，以5000×g離心5 min收集菌體，用PBS重懸后在冰上超聲裂解（振幅30 A，超聲3 min，間隔10秒）；然后用12 000×g4 ℃離心10 min，分別取上清和沉淀，用蛋白電泳buffer處理后進行SDS-PAGE電泳，同時將含有pET-32a的空載體菌按同樣方式進行誘導作為對照。將含有目的蛋白的細菌裂解液上清用0.45 μm濾器過濾，然后用GE公司HiTrap親和柱進行純化，將純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢驗純化效果。

1.10 Western-blot鑒定將純化的chβ2m融合蛋白經SDS-PAGE后，在冰上以50 V轉印2 h到NC膜。參照文獻[9]報道方法，轉印后將膜放入含5 %脫脂乳的TBST中4 ℃封閉過夜或37 ℃水浴搖床封閉2 h；倒掉封閉液，加入一抗（抗His單抗和抗chβ2m單抗，抗體用含有5 %脫脂乳的TBST 1: 1000稀釋)，37 ℃水浴搖床內作用1 h；于搖床上用TBST洗膜3次，每次5 min；加入AP標記的山羊抗鼠IgG （含5 %脫脂乳TBST 1:6000 稀釋），37 ℃作用1 h；搖床上用TBST洗膜5次，每次5 min；BCIP/NBT（BCIP/NBT與ddw 1:10稀釋）避光顯色，待出現(xiàn)特異性目的條帶時立即用水沖洗終止反應。

2 結果

2.1 chβ2m基因的擴增與鑒定chβ2m基因擴增PCR產物經瓊脂糖核酸電泳，結果顯示，在約360 bp左右可見特異性條帶，與預期大小相一致（圖1）。然后分別用EcoR ? 和Xho? 酶切重組質粒pGEM-T-chβ2m后可見3000 bp T載體條帶和360 bp的目的條帶（圖2A）；進一步用EcoR I和序列內部酶切位點BamH I雙酶切質粒pGEM-T-chβ2m仍然可見3000 bp T載體條帶和360 bp左右的目的條帶（圖2B）；挑取陽性菌落測序比對后發(fā)現(xiàn)，與已登錄的chβ2m序列（GenBank：M84767.1、AY989898、Z48921）相一致，同源性為100%。以上結果均說明重組質粒pGEM-T-chβ2m構建成功。

圖1 chβ2m的PCR擴增Fig.1 Amplif cation of chβ2m by PCR

2.2 重組質粒pET-32a-chβ2m的酶切鑒定將重組質粒pET-32a-chβ2m進行酶切鑒定，經EcoR I 和XhoI酶切可見6000 bp的空載體條帶和360 bp的目的條帶（圖3），進一步用EcoR I和BamH I酶切，同樣可見6000 bp的空載體條帶和360 bp左右的目的條帶（圖3），與預期大小相一致，說明重組chβ2m的原核表達載體pET-32a-chβ2m構建成功。

圖2 pGEM-T-chβ2m的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme analysis of pGEM-T-chβ2m plasmid

圖3 pET-32a-chβ2m的酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme analysis of pET-32a- chβ2m plasmid

2.3 融合蛋白的表達將含重組質粒pET-32a-chβ2m的BL21（DE3）經不同濃度的IPTG （0.4 mmol/L和0.8 mmol/L)進行誘導表達進行 SDS-PAGE。結果如圖4顯示，經IPTG誘導后，宿主菌表達的chβ2m融合主要以可溶性表達位于裂解上清中，在34 kDa左右可見明顯的融合蛋白條帶（與預期大小相一致），而對照組宿主菌中主要可見22 kDa左右的空載體蛋白。另外，用不同濃度的IPTG誘導發(fā)現(xiàn)，0.8 mmol/L IPTG要明顯多于0.4 mmol/L IPTG誘導表達的蛋白量（圖4）。

2.4 融合蛋白的純化His標簽過柱純化后，結果顯示，在34 kDa處僅見純化的chβ2m融合蛋白，無其他雜帶，說明通過此方法可以得到較純的chβ2m融合蛋白（圖5）。

圖4 雞β2m融合蛋白的誘導表達Fig.4 Expression of pET-32a-chβ2m in BL21(DE3) induced by IPTG

圖5 chβ2m融合蛋白的純化Fig.5 The purif cation of chβ2m fusion proteins

2.5 融合蛋白的鑒定利用抗His標簽蛋白的單抗和抗β2m單抗進行純化蛋白的Western-blot，結果顯示抗His標簽蛋白的單抗能與His-chβ2m和His標簽蛋白都發(fā)生特異性反應，分別在34 kDa與20 kDa處出現(xiàn)反應條帶（圖6A）；而抗β2m單抗只能與Hischβ2m發(fā)生特異性反應，在34 kDa處出現(xiàn)反應條帶，與His標簽蛋白不反應 （圖6B），證明chβ2m融合蛋白得到了正確表達，并能與特異性的抗β2m單抗反應。

3 討論

β2m作為MHC-I類分子復合物的輕鏈分子，可促進抗原肽與MHC-I類分子的結合，對穩(wěn)定MHC-I類分子結構和發(fā)揮MHC-I有效提呈抗原肽功能必不可少[10]。雖然所有有核細胞均可表達β2m，但是鑒于β2m的表達與細胞免疫水平相關，因此為了能成功克隆出特異性chβ2m全長序列，本研究在選擇克隆chβ2m模板時，以提取具有較高免疫水平雞外周血淋巴細胞總RNA為模板，通過RT-PCR方法進行擴增。結果表明，本研究根據(jù)此方法成功克隆出包含信號肽在內的chβ2m全長片段，并且電泳后顯示僅在約360 bp左右可見特異性條帶，條帶單一，具有較高的擴增效率，可便于chβ2m進一步的回收與克隆操作。

圖6 Western-blot 分析純化的chβ2m融合蛋白Fig.6 The purif cation of chβ2m fusion proteins

pET原核表達系統(tǒng)是目前利用大腸桿菌克隆表達重組蛋白功能最強大的系統(tǒng)。經過人工改造后，pET系統(tǒng)可受噬菌體 T7強轉錄及翻譯信號控制。將目的基因克隆到pET質粒載體上后，表達可由宿主細胞提供的T7 RNA聚合酶誘導。鑒于T7 RNA 聚合酶機制十分有效并具選擇性，在充分誘導時，幾乎所有細胞資源都可用于目的蛋白的表達，并且在誘導表達后僅數(shù)小時之內目的蛋白就可以占到細胞總蛋白的50%以上[11]。因此，利用該系統(tǒng)很容易獲得目的蛋白的高效表達。然而不同的克隆策略、對限制性酶切位點以及閱讀框的不同要求，會影響對載體的選擇。即便不同載體表達相同蛋白也會出現(xiàn)不同的表達形式。在我國，張勁等[12]利用pET-23a表達系統(tǒng)完成了對人β2m的高效表達，而該原核系統(tǒng)表達的人β2m大部分在包涵體中。后來，張蕾等[13]去掉信號肽后利用pET-28表達人β2m成熟肽蛋白，結果發(fā)現(xiàn)重組蛋白可以表達在菌體包涵體、質周腔、胞質及培養(yǎng)上清液4個部位，可惜的是大部分蛋白仍位于包涵體中。針對雞β2m，劉光亮等[14]嘗試將雞β2m在pET28a（+）中進行表達，發(fā)現(xiàn)去掉信號肽后可大大提高chβ2m表達量，但是表達的chβ2m成熟肽蛋白仍以包涵體形式存在。通過原核誘導表達的重組蛋白，目的蛋白以包涵體形式表達雖然具有表達量高、不易被降解等優(yōu)點。然而蛋白在迅速表達形成的包涵體中，往往缺乏有效的折疊[15]，并且在后期純化需要復性過程，操作相對復雜。能夠獲得可溶性表達蛋白是最理想的選擇。在本研究中我們選擇以pET32a（+）載體在BL21（DE3）中進行誘導表達雞β2m蛋白。結果發(fā)現(xiàn)，IPTG誘導后chβ2m主要以可溶性形式存在，并且我們利用載體上的His標簽通過鎳親和柱得到了較高純度的重組chβ2m蛋白。因此，以原核表達系統(tǒng)pET32a制備chβ2m是獲取該蛋白可靠、穩(wěn)定、實用的方法，并且在不丟棄信號肽的情況下仍然能夠獲得大量的可溶性蛋白，進一步保證了該蛋白具有生物學功能的可行性研究。

總之，在本研究中我們成功克隆并表達了chβ2m重組蛋白，并且表達的chβ2m蛋白包含信號肽全長CDS功能序列，呈可溶性表達，純化后蛋白純度高，易大量獲得，可為進一步對chβ2m結構及其功能研究提供必要的材料。

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CLONING AND EXPRESSION OF CHICKEN β2-MICROGLOBULIN IN ESCHERICHIA COLI

XU Wen-cai1, LIU Qiu1, LI Dan1, HU Xu-ming1,2, WU Geng-hua2, QIAN Kun1,2,3, SHAO Hong-xia1,2,3, JIN Wen-jie1,2,3, QIN Ai-jian1,2,3
(1. Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009,China)

chβ2m gene was amplif ed from normal chicken peripheral blood lymphocytes by RT-PCR. It was cloned into pET-32a(+) vector and induced by IPTG, then purif ed with HiTrap aff nity column. The results showed that the sequence of chβ2m gene amplif ed from chickens by RT-PCR was the same as that previously reported (M84767, AY989898, Z48921) and consists of 360 bp encoding 120 amino acids (aa). Most of the soluble recombinant chβ2m proteins existed in the bacterial supernatant induced with 0.8 M IPTG. Only one band of molecular weight of 34 kDa was purif ed by ion-exchange chromatography. Western blotling assay demonstrated that anti-His-tag monoclonal antibody could specif cally recognize the recombinant protein. This work would provid us the basis materials for further study of the structure and functions of chβ2m.

β2-microglobulin; clone; prokaryotic expression

S858.312.42

A

1674-6422（2014）01-0063-06

2013-10-30

國家自然科學基金項目（31272560, 31072135）；教育部創(chuàng)新團隊項目（IRT0978)；江蘇省優(yōu)勢學科和江蘇省教育廳重大基礎研究（12KJA23001）項目資助

徐文財，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

秦愛建，E-mail：aijian@yzu.edu.cn