吳青紅　阮水良

吡格列酮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響

吳青紅阮水良

【摘要 】目的觀察吡格列酮對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激的影響。 方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和吡格列酮組（每組10只）。正常組全程飼以普通飼料，另兩組均給予高脂飲食。6周后每組各處死2只大鼠，驗(yàn)證NAFLD造模成功后，給予吡格列酮組大鼠10mg·kg-1·d-1吡格列酮灌胃，正常組、模型組給予相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。6周后處死并留取肝組織，行病理組織學(xué)檢查，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）的含量，免疫組織化學(xué)法檢測肝臟組織血紅蛋白氧合酶（HO）-1的表達(dá)。 結(jié)果與模型組相比，吡格列酮組大鼠肝組織病變改善，MDA的含量顯著下降，且該組肝臟組織內(nèi)HO-1表達(dá)較正常組、模型組均顯著升高（均P＜0.05）。 結(jié)論吡格列酮可誘導(dǎo)NAFLD大鼠肝臟組織內(nèi)HO-1的表達(dá)，減弱氧化應(yīng)激，可能是其改善NAFLD病理變化的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞 】吡格列酮非酒精性脂肪性肝病大鼠氧應(yīng)激血紅蛋白氧合酶

【 Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of pioglitazone on oxidative stress in rats with high fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsThirty SD rats were randomly divided into normal group,model group and pioglitazone group(n=10 in each).NAFLS was induced by feeding of high-fat diet in rats of model and pioglitazone groups.Rats in pioglitazone group were gavaged with 10mg/kg of pioglitazone daily;rats in normal and model groups received an equal volume of saline.Two rats from each group were sacrificed at the end of week 6 for pathological examination;and at the end of week 12 all rats were sacrificed.The histological examinations were performed,contents of malondialdehyde(MDA)and heme oxygenase-1(HO-1)in liver were determined.ResultsCompared with model group,the degrees of hepatic steatosis and inflammation were significantly alleviated and contents of MDA in liver were decreased in pioglitazone group(P＜0.05).The liver HO-1 levels were significantly higher in pioglitazone group than those in normal and model groups(P＜0.05).ConclusionPioglitazone can induce the expression of HO-1 in liver,which is associated with its protective effect on oxidative stress and attenuation of non-alcoholic fatty liver disease in rats.

【 Key words】 PioglitazoneNon-alcoholic fatty liver diseaseRatsOxidative sressHeme oxygenase-1

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為威脅人類健康的最常見慢性肝病之一[1]，它的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，廣為大家接受的是“二次打擊”學(xué)說。雖然目前該學(xué)說受到一定的質(zhì)疑，但氧應(yīng)激在NAFLD疾病進(jìn)展中的重要作用已得到很多學(xué)者的認(rèn)可[2]。過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）γ作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控包括抗氧化酶在內(nèi)的多種基因的表達(dá)，近年來，有少量國內(nèi)外研究表明其激動(dòng)劑-吡格列酮可抑制氧化應(yīng)激的增加，而關(guān)于吡格列酮對(duì)NAFLD氧化應(yīng)激的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NAFLD模型，用吡格列酮進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)該模型鼠的作用，并檢測肝臟組織丙二醛（MDA）含量及血紅蛋白氧合酶（HO）-1的表達(dá)，探討吡格列酮對(duì)NAFLD的作用及其機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SCXK（滬）公司。飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物房，溫度（20±2）℃，12h晝夜交替，按實(shí)驗(yàn)要求給予相應(yīng)飼料喂養(yǎng)，各組動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2主要試劑、儀器鹽酸吡格列酮片（商品名：艾可拓，日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社），考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所），丙二醛（MDA）試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司），UNICO7200分光光度計(jì)（美國UNICO公司），RM2235石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），兔抗鼠HO-1抗體（美國 Abcam公司），DAB顯色試劑盒（基爾頓生物科技上海有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1NAFLD模型復(fù)制30只SD大鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和吡格列酮組，每組10只。正常組繼續(xù)飼以普通飼料，后兩組均飼以高脂飼料（各營養(yǎng)成分供能比例為蛋白質(zhì)18.0%，脂肪45.0%，碳水化合物 37.0%，保存于4℃冰箱）。6周后每組隨機(jī)抽取2只大鼠處死，取肝臟組織行病理檢查，觀察NAFLD的造模情況。

1.2.2給藥和取材各組大鼠除繼續(xù)同前喂養(yǎng)外，吡格列酮組于每天固定時(shí)間給予吡格列酮10mg/kg體重（混懸液）灌胃，正常組和模型組分別給予相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。連續(xù)治療6周，末次給藥后，禁食12h，不禁水，氯胺酮麻醉（0.2ml/100g體重，腹腔注射）。處死后迅速取肝臟右葉的同一部位，切取數(shù)塊大小約為1.5cm×1.5cm×0.3cm的肝臟組織，放入中性甲醛溶液中固定，其余肝臟組織放入凍存管中，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1肉眼觀察各組大鼠肝臟的色澤、質(zhì)地等。

1.3.2組織病理學(xué)觀察取固定后的肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色。顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)改變情況。

1.3.3肝臟組織MDA含量的測定用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量后，硫代巴比妥酸法測定MDA的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，測試結(jié)果以“nmol/ mgprot”表示。

1.3.4肝臟組織內(nèi)HO-1的表達(dá)行免疫組織化學(xué)染色法檢查肝臟組織細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達(dá)及分布情況。將肝臟組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)抗原修復(fù)、正常血清封閉后，滴加HO-1多克隆兔抗鼠一抗后4℃過夜，次日滴加二抗，DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染后封片，陰性對(duì)照，用PBS替代一抗。光鏡下隨機(jī)選取每張切片3個(gè)不重復(fù)視野，測定陽性區(qū)域面積及光密度（OD）值。取平均OD值代表陽性表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。

2　結(jié)果

2.1肝臟大體觀正常組大鼠肝臟顏色深紅，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地較軟；模型組肝臟較正常組體積增大、色偏黃、表面有顆粒感，邊緣變鈍、質(zhì)脆、切面帶油膩，吡格列酮組大鼠肝臟色澤、質(zhì)地、體積均較模型組改善，與正常組接近。

2.2肝臟組織病理學(xué)觀察光鏡下見正常組大鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀整齊排列，肝細(xì)胞形態(tài)大小如常，無明顯脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肝細(xì)胞小葉結(jié)構(gòu)排列紊亂，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等，數(shù)量不一的脂肪空泡，肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變，并伴有不同程度的肝細(xì)胞碎屑樣壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，少數(shù)存在橋接壞死，部分出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥；吡格列酮組肝細(xì)胞脂肪變、炎癥程度均較模型組改善，詳見圖1。

2.3各組大鼠肝臟組織內(nèi)MDA的含量模型組肝組織內(nèi)MDA的含量為（1.02±0.15）mmol/mgprot，較正常組的（0.49±0.08）nmol/mgprot顯著增加（P＜0.05）；吡格列酮組為（0.55±0.11）nmol/mgprot，較模型組顯著下降（P＜0.05），且與正常組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　各組大鼠肝臟組織病理學(xué)檢查所見（A：正常組；B：模型組C：吡格列酮組；HE染色，×200）

2.4肝臟組織HO-1表達(dá)的變化HO-1免疫組織化學(xué)染色顯示，正常組大鼠肝臟無明顯陽性染色，模型組大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及肝臟組織浸潤的炎性細(xì)胞內(nèi)可見到弱陽性表達(dá)，吡格列酮組大鼠肝臟組織的上述部位呈棕褐色顆粒物強(qiáng)陽性表達(dá)，其中胞質(zhì)的染色較深，陽性染色OD值為0.31±0.04，較正常組的0.12±0.02、模型組的0.15±0.01均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3　討論

目前，噻唑烷二酮類藥物已廣泛用于治療代謝紊亂的相關(guān)性疾病，尤其是2型糖尿病的治療，其主要機(jī)制為通過作用于PPARγ而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善胰島素抵抗。PPARγ作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可與其特異性配體結(jié)合、激活，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多種基因的表達(dá)。近年來國內(nèi)外少數(shù)研究表明PPARγ可通過調(diào)節(jié)抗氧化、抗炎癥基因的表達(dá)，表現(xiàn)出非降糖降脂作用的獨(dú)立機(jī)體保護(hù)功效。如Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)活化PPARγ具有減弱急性肺損傷及呼吸窘迫綜合征過程中的炎癥反應(yīng)及氧應(yīng)激的作用，且該功效部分程度上與其誘導(dǎo)抗氧化酶HO-1，進(jìn)而調(diào)節(jié)高遷移率組蛋白的表達(dá)相關(guān)。近年來，PPARγ激動(dòng)劑-吡格列酮較強(qiáng)的抗氧化活性得到越來越多學(xué)者的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可降低炎癥反應(yīng)從而減弱鐵所導(dǎo)致的黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)氧化應(yīng)激，還可改善血管緊張素-Ⅱ造成的高血壓大鼠心臟收縮舒張功能紊亂，減少腎臟脂質(zhì)含量及蛋白尿[4-5]，且該作用與其維持HO-1的表達(dá)，進(jìn)而減弱氧應(yīng)激密切相關(guān)[6]。由此可見，吡格列酮可誘導(dǎo)和/或維持抗氧化酶HO-1的高表達(dá)，減弱氧化應(yīng)激及其相關(guān)的機(jī)體損傷。

HO-1是HO家族中的一種亞型，是血紅蛋白代謝的起始酶和限速酶。作為一種抗氧化酶，HO-1廣泛參與抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷，是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。NAFLD的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，最近的研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者體內(nèi)HO-1的表達(dá)增加，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示模型組大鼠肝臟組織內(nèi)HO-1表達(dá)較正常組升高，因此，正如Wang等[7]的推測，HO-1可能是機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激等損傷時(shí)的一種應(yīng)激性防護(hù)反應(yīng)。Inoue等[8]在研究蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎（NASH）時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲除Bach1基因（HO-1的轉(zhuǎn)錄抑制基因）組大鼠表現(xiàn)出HO-1高表達(dá)，同時(shí)在病理組織學(xué)上，炎癥、纖維化程度及肝臟組織內(nèi)氧應(yīng)激指標(biāo)MDA的水平均低于對(duì)照組。因此，我們推測，誘導(dǎo)及維持體內(nèi)HO-1高表達(dá)將有利于延緩NAFLD的進(jìn)展。目前，大量臨床前及臨床試驗(yàn)均表明PPARγ激動(dòng)劑-吡格列酮可改善NAFLD患者的生物代謝指標(biāo)和肝臟組織病理[9-10]，由此可知，吡格列酮可誘導(dǎo)及維持HO-1的高表達(dá)，但關(guān)于吡格列酮在NAFLD模型鼠中的抗氧化作用及其對(duì)HO-1的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD模型，并給予吡格列酮干預(yù)，觀察所見與眾多研究結(jié)果一致，該藥物可減輕高脂飲食所致的肝臟組織脂肪及炎癥病變，此外，吡格列酮干預(yù)組大鼠肝臟組織內(nèi)抗氧化酶HO-1的表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了PPARγ激動(dòng)劑可上調(diào)PPARs靶基因HO-1的表達(dá)。同時(shí)，吡格列酮組大鼠肝臟組織內(nèi)氧應(yīng)激指標(biāo)MDA的含量顯著降低，表明該藥物降低了NAFLD大鼠肝臟組織內(nèi)的氧化應(yīng)激。

基于NAFLD的發(fā)病機(jī)制及近年來關(guān)于吡格列酮抗氧化作用的研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)自造模成功始給予吡格列酮干預(yù)治療，以研究其抗氧化作用及對(duì)HO-1表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)吡格列酮可增加抗氧化酶HO-1的表達(dá)，降低氧化應(yīng)激，這可能是其改善NAFLD模型鼠肝臟組織病理的另一作用機(jī)制，但這一機(jī)制尚需更加深入的研究。

4　參考文獻(xiàn)

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（本文編輯：沈叔洪）

收稿日期：（2013-11-18）

作者單位：323800慶元縣中醫(yī)院消化內(nèi)科（吳青紅）；嘉興市第二醫(yī)院消化內(nèi)科（阮水良）

通信作者：阮水良，E-mail：ruanguan@aliyun.com

Effects of pioglitazone on oxidative stress in rats with non-alcoholic fatty liver disease

WU Qinghong，RUAN Shuiliang.Department of Gastroenterology,Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lishui 323800,China