魏任雄 李克強(qiáng) 毛聯(lián)鋼 李旭軍 馮偉云

●論 著

靶向干擾CDK2AP1對乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外遷移和侵襲的影響

魏任雄 李克強(qiáng) 毛聯(lián)鋼 李旭軍 馮偉云

目的 探討靶向干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶2-關(guān)聯(lián)蛋白-1（CDK2AP1）對乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外遷移和侵襲的影響。 方法 構(gòu)建重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA及重組空病毒pGCLV-GFP，分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，獲得乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1。采用定量PCR法檢測兩組MCF-7細(xì)胞株的CDK2AP1mRNA表達(dá)，xCELLigence/RT-CIM實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析系統(tǒng)檢測細(xì)胞遷移能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力。 結(jié)果 成功構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1，相比MCF-7/RNAi-NC細(xì)胞組，MCF-7/RNAi-CDK2AP1細(xì)胞組的CDK2AP1mRNA表達(dá)受到明顯抑制，其細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著下降（P＜0.05）。 結(jié)論 乳腺癌細(xì)胞MCF-7中CDK2AP1低表達(dá)能有效抑制細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。

乳腺癌 CDK2AP1 shRNA 細(xì)胞遷移 細(xì)胞侵襲

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤之一，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的最主要原因[1-2]。手術(shù)、化療和放療可以控制許多局部腫瘤，但仍無法完全根治腫瘤的轉(zhuǎn)移[3]。因此，進(jìn)一步探索乳腺癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，對于乳腺癌的臨床治療具有重要意義。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶2-關(guān)聯(lián)蛋白-1（CDK2-associated protein 1，CDK2AP1）定位于染色體12q24.31，由115個(gè)氨基酸組成，基因全長1 627bp，主要分布于腦、肺、乳腺、肝臟、胰腺、脾臟、腎臟、脊髓、前列腺、卵巢等部位[4]。CDK2AP1是CDK2基因的一個(gè)特異性負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，負(fù)責(zé)分解CDK2，同時(shí)能夠直接與DNA聚合酶α反應(yīng)，影響細(xì)胞S期DNA復(fù)制調(diào)節(jié)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[5-7]。近年有學(xué)者報(bào)道，在CDK2AP1低表達(dá)的食管癌、胃癌的患者預(yù)后較差，易發(fā)生轉(zhuǎn)移[8-9]。本研究通過shRNA靶向干擾CDK2AP1，觀察其對乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7和SUM-159購自中科院細(xì)胞所；Gibco分裝RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自美國Invitrogen公司；重組空病毒pGCLV-GFP和重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA病毒液購自吉?jiǎng)P公司；polybrene購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；細(xì)胞總RNA抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司；CDK2AP1及β-actin基因引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；Transwell小室購自美國Promega公司；鼠抗人CDK2AP1單克隆抗體及ElivisionTM試劑盒均購于基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231、MCF-7和SUM-159乳腺癌細(xì)胞系常規(guī)復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10%FBS的PRMI1640培養(yǎng)基中（加入1×105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素），置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.2 3種乳腺癌細(xì)胞株中CDK2AP1 mRNA的表達(dá)采用定量PCR檢測。3種乳腺癌細(xì)胞系用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，用DU800型紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將所得的cDNA進(jìn)行定量PCR檢測。根據(jù)Genebank上CDK2AP1序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物，CDK2AP1-F：AAGGAGCAACCCACCAAACC；CDK2AP1-R：ATCAACTTACAATAAACGCAGAAC?？醇一颚?actinDNA擴(kuò)增引物，Actin-F：GGCGGCACCACCATGTACCCT；Actin-R：AGGGGCCGGACTCGTCATACT。PCR反應(yīng)體系中含有SYBR Premix Ex TaqTM 5μl，上下游引物各0.4μl，模板 cDNA 1μl，ROX Reference DyeⅡ 0.2μl，ddH2O 3.0μl，共10μl。PCR反應(yīng)條件：95℃45s，95℃5s，60℃35s，共38個(gè)循環(huán)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取Ct值，△Ct=樣本Ct均值-內(nèi)參照Ct均值，△△Ct=△Ct-（隨機(jī)陰性對照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參照Ct均值），目的基因mRNA的相對表達(dá)量以2-△△Ct表示。

1.2.3 重組慢病毒感染 取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔接種到6孔板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到30%，用polybrene（8μg/ml）預(yù)處理30min，重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA和pGCLV-GFP的病毒感染滴度均為3E+6（TU/ml），12h后更換新鮮PRMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后用熒光顯微鏡觀察感染后的兩組乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，計(jì)算重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

1.2.4 重組慢病毒感染的MCF-7細(xì)胞株CDK2AP1 mRNA表達(dá) 采用定量PCR檢測。按1.2.2所表述的相同方法步驟、PCR反應(yīng)參數(shù)及結(jié)果分析，分別檢測乳腺癌細(xì)胞MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1的CDK2AP1表達(dá)情況。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力 采用xCELLIigence/RT-CIM實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析系統(tǒng)分別檢測乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1體外遷移情況。將MCF-7/pGCLV和MCF-7/RNAi-CDK2AP1細(xì)胞分別放于不含血清培養(yǎng)基中生長4～24h。將培養(yǎng)基加入至底層小室，將頂層小室置于底層小室上面，并將兩者扣合在一起，以進(jìn)行CIM-Plate 16的裝配。在獲得背景測定前，將不含血清培養(yǎng)基放置于頂層小室中進(jìn)行水合處理，并將過濾膜放置于37℃的CO2孵育箱中1h，進(jìn)行預(yù)孵育處理。于不含血清培養(yǎng)基中對細(xì)胞進(jìn)行輕柔的胰酶消化處理，使細(xì)胞成團(tuán)狀，再重新懸浮細(xì)胞。對CIMPlate 16進(jìn)行平衡處理后，將CIM-Plate 16放置于RTCA DP儀器工作站中，并進(jìn)行背景細(xì)胞指數(shù)的測定。然后從RTCA DP儀器站中移除CIM-Plate 16，并將細(xì)胞加入至頂層中，細(xì)胞密度為理想密度。將CIM-Plate 16放置于RTCA DP儀器站中，每隔1h對細(xì)胞遷移情況進(jìn)行監(jiān)測，共持續(xù)65h，通過系統(tǒng)測量的阻抗得到細(xì)胞指數(shù)，反映遷移細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測。Transwell Chamber預(yù)鋪50μg/室Matrigel膠。乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1分別消化離心，重懸計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，分別取0.2ml接種于Transwell Chamber的上室，同時(shí)在Transwell Chamber下室加入含10%FBS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24～48h后取出，用棉簽頭擦去Matrigel，用PBS洗2～3次，甲醇固定后蘇木精染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，用10%醋酸脫色，測量洗脫液OD570值。OD值與穿膜的細(xì)胞數(shù)量成正比，從而間接反映細(xì)胞的侵襲能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CDK2AP1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，CDK2AP1 mRNA表達(dá)量由高到低依次為MCF-7＞MDA-MB-231＞SUM-159，見圖1。

2.2CDK2AP1穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的建立 選取CDK2AP1高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7進(jìn)行重組空病毒pGCLVGFP和重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA感染，同一視野白光和熒光下觀測MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后，MCF-7細(xì)胞株空病毒pGCLV-GFP（見圖2A、B）和重組慢病毒pGCLV-CDK2AP1-shRNA（見圖2C、D）轉(zhuǎn)導(dǎo)率均高于80%，綠色熒光蛋白GFP表達(dá)良好，成功構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/RNAi-NC和MCF-7/RNAi-CDK2AP1。

圖1 3種乳腺癌細(xì)胞系中CDK2AP1 mRNA表達(dá)量

圖2 MCF-7轉(zhuǎn)染48h后綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)（A：MCF-7/ RNAi-NC細(xì)胞明場下細(xì)胞形態(tài)；B：MCF-7/RNAi-NC細(xì)胞暗場下熒光激發(fā)GFP發(fā)光情況；C：MCF-7/RNAi-CDK2AP1細(xì)胞明場下細(xì)胞形態(tài)；D：MCF-7/RNAi-CDK2AP1 GFP細(xì)胞暗場下熒光激發(fā)GFP發(fā)光情況；×100）

2.3 重組慢病毒感染的MCF-7細(xì)胞株CDK2AP1表達(dá) 通過熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒對MCF-7的表達(dá)有較好的干擾抑制作用，相比MCF-7/ RNAi-NC細(xì)胞組，MCF-7/RNAi-CDK2AP1細(xì)胞組的CDK2AP1mRNA表達(dá)受到明顯的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 重組慢病毒感染的MCF-7細(xì)胞株CDK2AP1表達(dá)情況

2.4 抑制CDK2AP1的表達(dá)對MCF-7遷移能力的影響 檢測發(fā)現(xiàn)，30～60h MCF-7/RNAi-NC細(xì)胞信號明顯高于MCF-7/RNAi-CDK2AP1，表明MCF-7/RNAi-CDK2AP1較MCF-7/RNAi-NC細(xì)胞遷移能力明顯降低，說明下調(diào)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 CDK2AP1的表達(dá)，其腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞遷移能力明顯下降，見圖3。

圖3 xCELLigence（RT-CIM）對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/RNAi-NC與MCF-7/RNAi-CDK2AP1遷移運(yùn)動(dòng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測動(dòng)態(tài)圖（A：MCF-7/RNAi-NC細(xì)胞遷移情況；B：MCF-7/RNAi-CDK2AP1細(xì)胞遷移情況）

2.5 抑制CDK2AP1的表達(dá)對MCF-7侵襲能力的影響 結(jié)果顯示下調(diào)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 CDK2AP1的表達(dá)，其腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 MCF-7/RNAi-NC與MCF-7/RNAi-CDK2AP1乳腺癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（A：兩組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)染色圖，×200；B：兩組相對侵襲細(xì)胞數(shù)比較）

3 討論

乳腺癌現(xiàn)已成為中國女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一。我國乳腺癌的發(fā)病率和病死率都呈迅猛上升態(tài)勢。侵襲性與轉(zhuǎn)移能力是癌細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的最基本的特征，也是導(dǎo)致患者腫瘤復(fù)發(fā)，病情惡化而最終死亡的病理基礎(chǔ)。雖然乳腺癌治療方案不斷改進(jìn)，而侵襲轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的最主要原因。

CDK2AP1最早從倉鼠口腔癌模型中分離[10]。CDK2AP1先前的研究主要集中在口腔、頭頸腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控方面。CDK2AP1是CDK2基因的一個(gè)特異性負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，負(fù)責(zé)分解CDK2，同時(shí)能夠直接與DNA聚合酶α反應(yīng)，影響細(xì)胞S期DNA復(fù)制調(diào)節(jié)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[5-7]。有研究報(bào)道，TGF-β可激發(fā)CDK2AP1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）[11]。同時(shí)當(dāng)上調(diào)倉鼠頰囊癌細(xì)胞HCPC-1的CDK2AP1表達(dá)時(shí)，其誘導(dǎo)的EMT促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞鄰近侵襲和遷移，但抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。另有研究報(bào)道，臨床觀察發(fā)現(xiàn)在CDK2AP1低表達(dá)的食管癌、胃癌的患者中預(yù)后較差，發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況較多[8-9]。在本研究中，通過慢病毒穩(wěn)定干擾乳腺癌細(xì)胞CDK2AP1表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。

基于本研究和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究小組推斷CDK2AP1在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的可能作用及其機(jī)制為：CDK2AP1上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的形成，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞鄰近侵襲和細(xì)胞遷移能力；促進(jìn)CDK2的分解，降低乳腺癌在血流中的存活能力，抑制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移克隆的形成，以上推斷尚待進(jìn)一步研究進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，干擾CDK2AP1的表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，預(yù)示CDK2AP1在乳腺癌的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究將為CDK2AP1作為乳腺癌的有效治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

《浙江醫(yī)學(xué)》對圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼。每幅圖應(yīng)冠有圖題。說明性的文字應(yīng)置于圖下方注釋中，并在注釋中標(biāo)明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫。線條圖應(yīng)墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計(jì)算機(jī)制圖者應(yīng)提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對比度；圖中需標(biāo)注的符號（包括箭頭）請用另紙標(biāo)上，不要直接寫在照片上。每幅圖的背面應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明圖號、方向及作者姓名。若刊用人像，應(yīng)征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分。大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有尺度標(biāo)記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。圖表中如有引自他刊者，應(yīng)注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理內(nèi)容（如t值、P值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)有效位數(shù)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的1/3確定有效位數(shù)。

本刊編輯部

CDK2AP1 knockdown inhibits migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cell line in vitro

WEI Renxiong,LI Keqiang, MAO Lian'gang,et al.Department of Clinical Laboratory,Ningbo Second Municipal Hospital,Ningbo 315010,China

Human breast cancerCDK2AP1 shRNA Cell Migration Cell Invasion

2014-02-17）

寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2010A610046）

315010 寧波市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（魏任雄現(xiàn)在寧波市中醫(yī)院工作），臨床研究中心（李克強(qiáng)、毛聯(lián)鋼、馮偉云），乳腺外科（李旭軍）

李克強(qiáng)，E-mail:chasejxmc@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the role of cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1(CDK2AP1)in migration and invasion of human breast cancer cells. Methods Recombinant lentivirus pGCLV-CDK2AP1-shRNA and negative control pGCLV-GFP were constructed and transfected to human breast cancer MCF-7 cells.Migration and invasion ability of MCF-7 cells were determined with xCELLigence system and Transwell chamber assay,respectively. Results Recombinant lentivirus pGCLV-CDK2AP1-shRNA and negative control pGCLV-GFP were transfected into MCF-7 cells successfully.After transfection, expression levels of CDK2AP1 mRNA in MCF-7 cells were reduced significantly(P＜0.05).Compared to control MCF-7/RNAi -NC cells,MCF-7/RNAi-CDK2AP1 significantly decreased the migration and invasion ability of MCF-7 cells. Conclusion Silence of CDK2AP1 significantly inhibits migration and invasion of human breast cancer MCF-7 in vitro.