張靜琳* 易魁先 陳 韻 武哲明 吳斌斌 高汝龍

（愛爾眼科醫(yī)院集團(tuán)廣州愛爾眼科醫(yī)院，廣東 廣州510080）

槲皮素對(duì)高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制

張靜琳* 易魁先 陳 韻 武哲明 吳斌斌 高汝龍

（愛爾眼科醫(yī)院集團(tuán)廣州愛爾眼科醫(yī)院，廣東 廣州510080）

目的研究槲皮素對(duì)高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法將A-RPE19細(xì)胞系的細(xì)胞分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，其中高糖培養(yǎng)基內(nèi)分別加入0、50、100、150 mmol/L的槲皮素，培養(yǎng)24 h以后用TUNEL檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡，并根據(jù)該結(jié)果選取槲皮素的最佳作用濃度，進(jìn)行caspase3的免疫熒光染色，線粒體酶復(fù)合物的活性測(cè)定。結(jié)果高糖培養(yǎng)的RPE細(xì)胞的凋亡指數(shù)（TUNEL陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)）明顯高于對(duì)照組，槲皮素可以明顯抑制高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞的凋亡，其中以100 mmol/L的濃度作用效果最強(qiáng)，與高糖培養(yǎng)組相比，其差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高糖組的caspase3的免疫熒光染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組和高糖+100 mmol/L槲皮素組。線粒體復(fù)合酶Ⅱ的活性各組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高糖組的線粒體復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ的活性均明顯低于對(duì)照組和高糖+100 mmol/L槲皮素組（P＜0.05）。結(jié)論槲皮素可以抑制由高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞的凋亡，其作用是通過抑制caspase3的激活和線粒體保護(hù)實(shí)現(xiàn)的。

槲皮素；RPE細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）已成為21世紀(jì)世界范圍內(nèi)的一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病，是當(dāng)前世界各國(guó)共同面對(duì)的公共健康問題。氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。線粒體不僅是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化的中心，也是細(xì)胞內(nèi)自由基的主要來源[1]。班廷獎(jiǎng)得主Brownlee教授提出糖尿病并發(fā)癥發(fā)病的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說[2]：發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的經(jīng)典途徑——多元醇途徑、糖基化終末產(chǎn)物（AGE）途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑和氨基己糖途徑，均是在高糖環(huán)境下，由線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多導(dǎo)致的結(jié)果。槲皮素是黃酮類中分布最廣、抗氧化能力最強(qiáng)的一種天然藥物，其化學(xué)名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮（Pentahydroxyflavone），化學(xué)分子式為C15H10O7·xH2O，相對(duì)分子質(zhì)量為302.24。目前，槲皮素對(duì)糖尿病作用的體內(nèi)研究大多集中在心、肝和腎等器官方面，它能降低糖尿病動(dòng)物的血糖，保護(hù)肝臟胰島β細(xì)胞死亡[3-5]，減少腎功能損害[6]，提高心肌收縮功能等[7，8]。對(duì)糖尿病眼病，特別是DR的研究甚少。有研究稱槲皮素可以顯著地抑制由VO（acac）-2引起的線粒體毒性和細(xì)胞毒性[9]。因此，我們推斷槲皮素可能對(duì)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用，而且其保護(hù)作用是通過線粒體的保護(hù)而實(shí)現(xiàn)的。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了此課題，為其臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為中草藥的開發(fā)利用提供重要的研究線索，還可能為糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期防治提供新的藥物靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

將人RPE細(xì)胞APRE-19細(xì)胞株（購于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫）復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37.5 ℃，5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)融合后用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，選取第5～15代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分組：分為：①對(duì)照組，培養(yǎng)基葡萄糖濃度為5.6 mmol/L，培養(yǎng)基中不加入任何藥物；②高糖組，培養(yǎng)基葡萄糖濃度30 mmol/L；③高糖+不同濃度梯度槲皮素組，槲皮素的濃度分別為50、100、 150 mmol/L。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.3 試劑配制

槲皮素（美國(guó)Sigma公司）用二甲基亞楓（美國(guó)Sigma公司）溶解成10 mg/mL的溶液，抽濾滅菌。再用培養(yǎng)基配成相應(yīng)的濃度。

1.4 TUNEL計(jì)數(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡

細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，按照TUNEL試劑盒（美國(guó)Roche公司）指示，進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，在每張片子上隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。根據(jù)TUNEL結(jié)果選擇槲皮素的最佳作用濃度。

1.5 免疫熒光染色

細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min后，用甲醛冰醋酸（1∶1）混合液固定10 min后，用1∶200 Caspase3抗體（美國(guó)Cell Signaling公司，Cleaved Caspase-3抗體，#9664）孵育，4 ℃過夜，然后用anti-Rabbit的二抗（美國(guó)Molecular Probes公司的Alexa Fluor? 488 Donkey Anti-Rabbit IgG（H+L）Antibody）1∶400孵育1 h，進(jìn)行caspase3的免疫組織熒光染色。

1.6 線粒體酶復(fù)合物活性測(cè)定。

將細(xì)胞按線粒體提取試劑盒（美國(guó)Pierce公司）說明書提取線粒體溶液，將線粒體溶液以BCA法進(jìn)行蛋白定量[10]，根據(jù)定量結(jié)果稀釋為10 mg/mL，分裝保存于-70 ℃。

線粒體于-20 ℃/20 ℃反復(fù)凍融3次以破壞線粒體膜，測(cè)定溫度為30 ℃，反應(yīng)體積為1 mL。分別測(cè)定酶復(fù)合體Ⅰ酶復(fù)合體Ⅱ和酶復(fù)合體Ⅳ在特定波長(zhǎng)處的光吸收值，酶樣本活性（RI）=（△A/min×TV× 106）/（ε×l×SV）。其中，△A/min為每分鐘吸光度的變化，TV為反應(yīng)系統(tǒng)總體積，SV為樣本體積，ε為被測(cè)物的摩爾消光系數(shù)，l為光徑，酶活力以μmol/min/mg蛋白表示。

2 結(jié) 果

2.1 TUNEL結(jié)果

對(duì)照組中，TUNEL指數(shù)為0.1%；高糖組中，TUNEL指數(shù)為38.2%；與對(duì)照組相比差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05）。

高糖+50 mmol/L槲皮素組，TUNEL指數(shù)為16.7%；高糖+100 mmol/L槲皮素組，TUNEL指數(shù)為2.1%；高糖+150 mmol/L槲皮素組，TUNEL指數(shù)為15.7%。高糖+槲皮素組各個(gè)不同濃度均有保護(hù)高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡的作用，其中以100 mmol/L組的保護(hù)作用最強(qiáng)。與高糖組相比，具有明顯的保護(hù)作用（P=0.000＜0.05）。

2.2 免疫熒光染色

高糖組caspase3的免疫熒光染色明顯強(qiáng)于高糖+100 mmol/L槲皮素組和對(duì)照組。見圖1。

圖1 免疫熒光染色圖

2.3 線粒體復(fù)合酶活性測(cè)定

線粒體復(fù)合酶Ⅱ各組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而線粒體復(fù)合酶Ⅰ和線粒體復(fù)合酶Ⅳ中，高糖組的酶活性均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），高糖組明顯低于高糖+100 mmol/L槲皮素組，而對(duì)照組與高糖+100 mmol/L槲皮素組相比沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

高糖培養(yǎng)下的RPE細(xì)胞的線粒體復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ活性明顯降低，反映了線粒體功能的受損，而加入100 mmol/L的槲皮素可以使線粒體復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ活性顯著提高，說明槲皮素對(duì)高糖培養(yǎng)的RPE細(xì)胞的凋亡是通過改善線粒體的功能而實(shí)現(xiàn)的，見表1。

表1 不同糖濃度下線粒體復(fù)合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的活性比較

3 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜內(nèi)存在由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的線粒體的損害。已有研究模擬并證實(shí)了一條糖尿病早期視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的途徑：高糖血癥及其糖代謝異常引發(fā)視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激激活下游信號(hào)通路P38 MAPK，P38 MAPK通路將氧化應(yīng)激死亡信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[11]；同時(shí)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)異常，VEGF和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1 SDF-1）的“正反饋”，促進(jìn)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障（Blood-retinal Barrier，BRB）破壞[12]。而對(duì)DR患者玻璃體進(jìn)行測(cè)定，也發(fā)現(xiàn)了氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平顯著升高[13]。高糖誘導(dǎo)牛視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞后以及對(duì)糖尿病鼠視網(wǎng)膜組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ROS顯著增高，且增高的R0S主要來源于線粒體，因?yàn)殡娮觽鬟f鏈復(fù)合體Ⅱ抑制劑可完全抑制高糖對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的這種誘導(dǎo)作用，而NADPH氧化酶及一氧化氮合酶（NOS）抑制劑的作用微弱[14]。諸多的文獻(xiàn)的資料[15-20]表明，在糖尿病視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)中氧自由基的增加可導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)損害現(xiàn)象如：NK-κB被激活，Bax轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)。這些現(xiàn)象導(dǎo)致了細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而可激活caspase-9，隨后激活caspase-3，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡。

在本研究中，槲皮素組RPE細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著低于高糖培養(yǎng)的RPE細(xì)胞，高糖培養(yǎng)的RPE細(xì)胞的Caspase3染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組和槲皮素組，可見槲皮素是通過抑制caspase3的激活從而對(duì)高糖誘導(dǎo)的RPE凋亡起保護(hù)作用。此外，因糖尿病而增加的過氧化硝酸鹽亦加劇線粒體的功能不良。功能不良的線粒體可產(chǎn)生更多的氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致氧化損傷的惡性循環(huán)。在我們的研究中，高糖培養(yǎng)下的RPE細(xì)胞的線粒體復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ活性明顯降低，反映了線粒體功能的受損，而100 mmol/L的槲皮素可以使線粒體復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ活性顯著提高，說明槲皮素對(duì)高糖培養(yǎng)的RPE細(xì)胞的凋亡是通過改善線粒體的功能而實(shí)現(xiàn)的。因此，如果我們?cè)贒R發(fā)展的早期就進(jìn)行線粒體的保護(hù)，有望阻止DR的進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為DR的早期預(yù)防和治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。

[1] Wallace DC.Mitochondrial genetics:a paradigm for aging and degenerative diseases?[J] Science,1992,256(5057):628-632.

[2] Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism[J].Diabetes,2005,54(6):1615-1625.

[3] Maher P,Hanneken A.Flavonoids protect retinal ganglion cells from oxidative stress-induced death[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46(12):4796-4803.

[4] Dias AS.Quercetin decreases oxidative stress,NF-kappaB activation,and iNOS overexpression in liver of streptozotocininduced diabetic rats[J].J Nutr,2005,135(10): 2299-2304.

[5] Coskun O.Quercetin,a flavonoid antioxidant,prevents and protects streptozotocin-induced oxidative stress and beta-cell damage in rat pancreas[J].Pharmacol Res,2005,51(2):117-123.

[6] Ramachandra R,Shetty AK,Salimath PV.Quercetin alleviates activities of intestinal and renal disaccharidases in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Mol Nutr Food Res,2005,49(4):355-360.

[7] Cacicedo JM.Palmitate-induced apoptosis in cultured bovine retinal pericytes:roles of NAD(P)H oxidase,oxidant stress,and ceramide[J].Diabetes,2005,54(6):1838-1845.

[8] Krishna KM.Partial reversal by rutin and quercetin of impaired cardiac function in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Can J Physiol Pharmacol,2005,83(4):343-355.

[9] Wang YZ.Quercetin and green tea polyphenols inhibit the mitochondrial damages and cytotoxicity induced by VO(acac)2[J].J Chin Pharm Sci,2009,18(3):7.

[10] Wu Y.Transfection of hepatic stimulator substance gene desensitizes hepatoma cells to H2O2-induced cell apoptosis via preservation of mitochondria[J].Arch Biochem Biophys,2007, 464(1):48-56.

[11] Li YH.Caspase-dependent retinal ganglion cell apoptosis in the rat model of acute diabetes[J].Chin Med J(Engl),2008,121(24):2 566-2571.

[12] Chen L.Vitreous levels of stromal cell-derived factor-1 and vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy[J]. Yan Ke Xue Bao,2008,24(1):6-8.

[13] Cicik E.Interleukin-8,nitric oxide and glutathione status in proliferative vitreoretinopathy and proliferative diabetic retinopathy[J].Ophthalmic Res,2003,35(5):251-255.

[14] Du Y,Miller CM,Kern TS.Hyperglycemia increases mitochondrial superoxide in retina and retinal cells[J].Free Radic Biol Med,2003,35(11):1491-1499.

[15] Kowluru RA,Abbas SN.Diabetes-induced mitochondrial dysfunction in the retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44(12):5327-5334.

[16] Li L,Renier G.Activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form)oxidase by advanced glycation end products links oxidative stress to altered retinal vascular endothelial growth factor expression[J].Metabolism,2006,55(11): 1516-1523.

[17] Chen BH,Jiang DY,Tang LS.Advanced glycation end-products induce apoptosis involving the signaling pathways of oxidative stress in bovine retinal pericytes[J].Life Sci,2006,79(11):1040-1048.

[18] Kowluru RA.Effect of advanced glycation end products on accelerated apoptosis of retinal capillary cells under in vitro conditions[J].Life Sci,2005,76(9):1051-1060.

[19] Yamagishi S.Pigment epithelium-derived factor(PEDF)prevents diabetes-or advanced glycation end products(AGE)-elicited retinal leukostasis[J].Microvasc Res,2006,72(1-2): 86-90.

[20] Yamagishi S.Pigment epithelium-derived factor inhibits advanced glycation end product-induced retinal vascular hyperpermeability by blocking reactive oxygen speciesmediated vascular endothelial growth factor expression[J].J Biol Chem,2006,281(29):20213-20220.

R733.7

B

1671-8194（2014）11-0064-03

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（201102A213221）

*通訊作者：E-mail： zhjinglin@126.com