張莎莎崔 琳宰軍華* 李 強，3路玲玲

（1 河南中醫(yī)學院，河南 鄭州，450008；2 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州4500003 河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河南 鄭州450000）

PAI-1啟動子序列與熒光素酶報告基因擴增及載體連接問題分析*

張莎莎1崔 琳2宰軍華2* 李 強2，3路玲玲1

（1 河南中醫(yī)學院，河南 鄭州，450008；2 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州4500003 河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河南 鄭州450000）

目的探討纖溶酶原激活物抑制劑-1（Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）啟動子熒光素酶表達質(zhì)粒構建中擴增、轉(zhuǎn)化、酶切及連接的問題。方法利用PCR技術擴增1100 bp長度PAI-1啟動子片段，與PUC-19T載體連接，將PUC19T-PAI-1 1100質(zhì)粒，及熒光素酶報告基因pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸肝菌（DH5a）后擴增，提取并純化；以BglⅡ，MluⅠ酶切，電泳并回收PAI-1 1100片段和pGL3-Basic酶切大片段，將PAI-1 1100片段插入熒光素酶報告基因pGL3-Basic中，構建含PAI-1 1100片段熒光素酶質(zhì)粒。結(jié)果擴增PAI-1 1100 bp片段成功，目的片段與載體PUC19T，pGL3-Basic載體連接條件較苛刻，需要增加連接時間及效率的摸索。結(jié)論 控制擴增時DNA濃度，膠回收，感受態(tài)質(zhì)量，LB平板質(zhì)量，內(nèi)切酶，連接時間及質(zhì)量比等問題都可增加連接成功概率。

PAI-1；啟動子；熒光素酶報告基因；載體連接

基因重組技術是我們在分子生物學研究中較常使用到的基本技術，也是分子生物學實驗的基礎，它在現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究中應用越來越廣泛。載體構建是將外源性DNA目的片段通過重組技術轉(zhuǎn)化入受體細胞中繁殖及表達，人工構建為需要的目的質(zhì)粒，為進一步實驗做基礎[1，2]。當外源性DNA片段插入到相應載體內(nèi)時，由于操作方法繁瑣，所需時間長，人為性因素較大，容易導致實驗難以繼續(xù)。本文根據(jù)自身操作，在擴增、酶切及連接問題上進行總結(jié)，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 試劑

報告基因表達載體pGL-3Basic（PromegaE6721）、PUC19T載體（TAKARA公司D）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株（TAKARA公司D9057A）、人血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技公司）、PCR擴增mix（北京康為公司CW0069）、DNA marker V、500 bp DNA marker（上海萊楓生物科技有限公司）；DNA凝膠回收試劑盒（GX50）、DNA質(zhì)粒小量提取試劑盒（Axygen公司AP-MN）；限制性內(nèi)切酶BglⅡ（Fermentas公司ER0561）和MluⅠ（Fermentas公司ER0081）、T4 DNA連接酶（Fermentas公司ER0041）；瓊脂糖（美國Invitrogen公司）。

1.2 儀器

PCR儀（美國Applied Biosystems公司），電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），UVIpro型凝膠成像分析系統(tǒng)（英國Silver Uvitec公司），Milli-Q型超純水儀（美國Milipore公司），Thermo-I368超低溫冰箱，高速低溫離心機（德國heraus公司），恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082型上海精宏實驗設備有限公司），微量離心機（Thermo 公司 MICR017）。

2 方 法

2.1 PAI-1 1100片斷的擴增

按試劑盒操作提取人全血基因組DNA，根據(jù)設計的引物PCR擴增目的基因組DNA，1.1kb上游：5‘CGACGCGTGAGCCTAACTTTCC GACTG3’；下游：5‘GAAGATCTTCTGCCCTCTGCCTGTG3’，反應體系：PCR mix25 μL，上游引物：1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 10 μL，ddH2O 13 μL，總反應體系50 μL。反應條件：95 ℃，預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，35個循環(huán)。取5 u PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射燈下觀察電泳條帶并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照[3]。

2.2 PUC19T-PAI-1 1100連接反應

獲取表達載體的信息，根據(jù)試劑盒操作進行連接反應。連接體系：PUC19T 1 μL，solutionⅠ5 μL，DNA產(chǎn)物：4 μL，總10 μL，16度連接3 h，見圖1、圖2。

2.3 PUC19T-PAI-1 1100及PGL-3 Basic質(zhì)粒的提取

將連接的PUC19T-PAI-1 1100及pGL-3 Basic轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中。具體操作步驟如下：取3支100 μL感受態(tài)細菌于冰上融化，在其中2支分別小心加入連接產(chǎn)物，另一支陽性對照，輕輕混勻，冰水浴30 min，42 ℃熱休克90 s，快速冰浴5 min，使其驟冷。加入800 μL不含Amp的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床150 rpm培養(yǎng)1 h。3000 rpm離心3 min，棄上清，余200 μL液體使沉淀重懸，涂布于含Amp的固體LB平板上，待液體完全吸收后，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第2天挑取陽性克隆，使用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，進行雙酶切，電泳鑒定后，純化PAI-1 1100片段和pGL-3 basic質(zhì)粒，獲得目的質(zhì)粒[4]。

2.4 pGL3 Basic-PAI-1 1100的連接

雙酶切PAI-1 1100片斷及pGL-3 Basic質(zhì)粒，取5 μL瓊脂糖凝膠分析后，進行純化回收，再次電泳鑒定后，根據(jù)試劑盒操作進行連接反應。連接體系：T4DNA Ligase 2 μL，T4 buffer 1 μL，DNA產(chǎn)物：13 μL，pGL-3 Basic 4 μL，總20 μL，16度連接過夜。

2.5 pGL3 Basic-PAI-1 1100的轉(zhuǎn)化：按2.3步驟進行。

2.6 質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒DNA并酶切鑒定，待第2天觀察連接轉(zhuǎn)化的固體LB平板，如果長出單個菌落，挑菌搖菌小提后酶切初步鑒定。

3 結(jié) 果

實驗證明，擴增時DNA濃度問題，感受態(tài)問題，內(nèi)切酶問題及連接產(chǎn)物質(zhì)量比等都會導致實驗室敗。

3.1 擴增條件及結(jié)果分析

擴增PAI-1 1100啟動子片段，并將之與PUC19T載體連接，提取后酶切純化，獲得目的片段。

3.2 連接產(chǎn)物酶切純化后電泳

見圖3、圖4。

圖1 pGL-3 Basic質(zhì)粒載體表達信息

圖2 pUC19T連接載體表達信息

圖3 連接產(chǎn)物酶切圖

圖4 模板量過大導致的大量多聚體

3.3 連接后轉(zhuǎn)化

將酶切后的質(zhì)粒與片段連接后，經(jīng)反復實驗，LB平板上仍長不出菌斑（圖5），提示載體未與目的片段連接成功（圖6）。

圖5 感受態(tài)效率低下導致的連接產(chǎn)物空載

圖6 連接比例錯誤導致的空載

4 討 論

基因重組技術是分子生物學的核心技術，它從基因組DNA的提取，載體的選擇，目的片段的擴增，限制酶的切割，載體的連接，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒的提取，每一步都可能產(chǎn)生問題，導致載體與目的片段不能正常連接，現(xiàn)分析如下：

4.1 ①DNA模板量過大會導致PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多聚體（圖4）在基因重組實驗中，基因組DNA的質(zhì)量是后續(xù)所有實驗的基礎，所以，首先應保證提取高濃度的基因組DNA。人基因組DNA多存在于血白細胞內(nèi)，因此，應從白細胞中提取高濃度的DNA。②膠回收問題，如果切膠時目的片段切不完全，或者切到雜帶，可能導致回收到的不是目的片段。切膠時，要保證回收到目的片段，而且膠不能再紫外線下暴露過長時間，融膠時間不能太短，以免融膠不完全，堵塞柱子，影響回收效率[5]。

4.2 感受態(tài)問題，由于使用效率不高的感受態(tài)，造成空載（圖5）。感受態(tài)細胞是處理后容易接受外來DNA進入的細胞，因此，應選擇高效率的感受態(tài)，才能使連接產(chǎn)物容易轉(zhuǎn)化入感受態(tài)內(nèi)。建議在鋪板時同時取20 μL感受態(tài)鋪于Amp陰性LB平板上，觀察感受態(tài)生長狀況，確保沒有因感受態(tài)問題影響實驗進行。

4.3 LB平板的問題，主要是鋪板加入Amp時溫度的問題，加入Amp時溫度過高，就會導致Amp抗性失活，從而導致克隆菌斑無法篩選出來（圖6）。一般選擇將消毒好的培養(yǎng)基放入60 ℃水浴鍋中，待培養(yǎng)基溫度降至60 ℃時加入Amp，以保證Amp的未失活。

4.4 內(nèi)切酶問題

①因公用buffer體積錯誤而導致酶切不開（圖7）限制酶的選擇非常重要，酶切位點選擇好后，就要選擇效率高的內(nèi)切酶，了解酶的特征，注意雙酶切時公用buffer的體積問題，確定合適的酶切體系?？捎脙晒苜|(zhì)粒同時進行，一管雙酶切，另一管先單酶切，然后再用另一個酶單切，判斷酶切質(zhì)量，保證酶切效率[6]。②酶切時間問題，酶切時間過長可能引起酶切太過，導致酶切產(chǎn)物丟失（圖8），應根據(jù)試劑盒選擇酶切溫度及時間，一般用16 ℃過夜或者37 ℃過夜，其實酶切時間3 h就足夠了。酶切完純化回收后，跑膠確定目的片段和載體回收回來，確保目的片段及載體仍在。

圖7 公用buffer錯誤導致的酶切錯誤

圖8 酶切時間過長導致的產(chǎn)物丟失

4.5 載體與目的片段的質(zhì)量比問題

如果連接時載體量過大，或者載體去磷酸化，或者連接上其他目的片段的載體，可能導致連接的不是目的片段（圖9）。連接時一般載體和目的片段的比例是1∶（3～10），如果連接時效率不高，排除感受態(tài)問題后，就要反復試驗載體與目的片段的摩爾比，最好電泳一下由亮度判斷載體與目的片段大致體積，或者測一下分別的濃度再選擇用量。

經(jīng)長期反復實驗總結(jié)，DNA的提取及模板量，膠回收，感受態(tài)質(zhì)量，平板質(zhì)量，到內(nèi)切酶用量及時間，以及載體的連接整個過程都應時刻注意。但是，由于一定的局限性，我們對載體構建原理及應用，實驗結(jié)果分析的能力都有很大的不足，因此，我們應嚴格操作，盡量避免實驗中的各種問題才得出正確的結(jié)果（圖10）。

圖9 質(zhì)量比錯誤導致的鏈接錯誤

圖10 排除各種問題后的正確結(jié)果

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R346

B

1671-8194（2014）11-0062-02

河南省教育廳自然科學研究資助計劃項目（2010B360009）；鄭州市科技公關計劃項目（0910SGYS33391-1）

*通訊作者：E-mail： zaijunh@163.com