陳霄峰 陳文芬 林明增 羅文達

bcr/abl陰性表達的骨髓增殖性腫瘤患者JAK2V617F基因突變的臨床研究

陳霄峰 陳文芬 林明增 羅文達

目的 探討JAK2V617F基因突變在bcr/abl陰性表達的骨髓增殖性腫瘤（MPN）患者中的發(fā)生率及臨床意義。方法應(yīng)用實時熒光PCR法檢測99例bcr/abl陰性表達的MPN患者的JAK2V617F基因突變。結(jié)果99例患者中發(fā)現(xiàn)70例（70．7%）JAK2V617F基因突變，其中真性紅細胞增多癥（PV）中突變發(fā)生率90．6%（29/32），原發(fā)性血小板增多癥（ET）中突變發(fā)生率62．5%（15/24），慢性特發(fā)性骨髓纖維化（CIMF）中突變發(fā)生率60．9%（14/23），骨髓增殖性腫瘤未分型（MPN-U）中突變發(fā)生率為60．0%（12/20）。PV患者的突變率高于ET、CIMF及MPN-U（P＜0．05或0．01）。JAK2V617F基因突變型患者的年齡大于野生型患者（P＜0．01），血白細胞計數(shù)和血紅蛋白水平高于野生型患者（P＜0．05或0．01）。結(jié)論bcr/abl陰性的MPN患者JAK2V617F基因突變發(fā)生率與疾病類型、年齡、外周血細胞計數(shù)相關(guān)，可以作為bcr/abl陰性MPN患者主要的分子遺傳學異常標志，有助于臨床診斷。

骨髓增殖性腫瘤 JAK2V617F基因突變 實時熒光PCR

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferativeneoplasms，MPN），既往稱骨髓增殖性疾?。╩yeloproliferative disorders，MPD），是一類起源于多能造血干細胞，以一系或多系分化相對成熟的骨髓細胞克隆性增殖異常為特點的一組異質(zhì)性疾病。按WHO分類，包括慢性粒細胞白血?。╟hronic myelocytic leukemia，CML）、真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocytosis，ET）、慢性特發(fā)性骨髓纖維化（chronic idiopathic myelofibrosis，CIMF）和骨髓增殖性腫瘤未分型（MPN unclassified，MPN-U）等。2005年James等[1]發(fā)現(xiàn)部分MPN患者存在的JAK2基因突變，對MPN的診斷和發(fā)病機制的研究等產(chǎn)生了重要影響。近年來筆者檢測了 99例 bcr/abl陰性表達的 MPN患者的JAK2V617F基因突變情況，并結(jié)合臨床進一步分析以探討其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2010-01—2014-04本院門診及住院初診為MPN的患者共99例（MPN組）。其中男54例，女45例，年齡25～85歲，平均（53.6±8.4）歲，中位年齡52歲。按照2001年WHO分型診斷標準[2]，PV 32例、ET 24例、CIMF 23例、MPN-U 20例。對照組20例為本院健康體檢者，其中男11例，女9例，平均（52.3±7.1）歲。兩組間年齡及性別比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 抽取受試者骨髓或外周血3ml，EDTA抗凝，標本送檢至杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心，以DNA抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品），抽提基因組DNA，具體操作按照試劑盒說明書進行，根據(jù)分光計測量濃度并確定純度后，DNA終濃度調(diào)節(jié)為200ng/μl。

1.2.2 JAK2V617F基因突變檢測 采用實時熒光PCR法檢測（ABL 7500），引物由艾迪康醫(yī)學檢驗中心自行設(shè)計，于TAKARA公司合成，正義引物1條，反義引物1條，野生型和突變型探針各1條由上?；倒竞铣伞CR反應(yīng)體系為：使用TOYOBO THUNDERBIRD qPCR Mix成品試劑盒，模板2μl，按試劑盒要求加入PCR擴增體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1min；95℃10s，60℃1min，共45個循環(huán)，60℃1min采集熒光信號，陽性對照使用陽性質(zhì)粒，空白對照使用雙蒸水，擴增后直接使用熒光PCR分析軟件分析檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料多組間比較先用行×列表的χ2檢驗，再行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 JAK2V617F基因?qū)崟r熒光PCR檢測結(jié)果 見圖1。

圖1 JAK2V617F基因?qū)崟r熒光PCR檢測結(jié)果示意圖[縱坐標代表熒光強度，橫坐標代表循環(huán)參數(shù)（CT）值。純合突變指只有一種突變基因型的樣本，雜合突變就是既有突變型又有野生型存在的樣本。JAK2V617F基因突變陽性即為JAK2V617F雜合突變或純合突變（突變型），JAK2V617F基因突變陰性即為JAK2V617F未突變（野生型）]

2.2 JAK2V617F基因突變與患者臨床特征的關(guān)系 99例MPN患者中JAK2V617F基因突變陽性共70例。PV、ET、CIMF和MPN-U患者中JAK2V617F基因突變發(fā)生率分別為90.6%、62.5%、60.9%和60.0%，對照組未檢出突變。PV組分別與ET、CIMF、MPN-U組比較，突變發(fā)生率均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或0.01），但ET、CIMF和MPN-U 3組間比較，突變發(fā)生率無統(tǒng)計學差異（χ2=0.67，P＞0.05）。

JAK2V617F基因突變型患者平均年齡大于野生型患者[（57.5±8.4）歲vs（43.2±4.8）歲，t=5.81，P＜0.01]，在PV、ET和MPN-U組中，基因突變型患者的平均年齡均高于野生型（均P＜0.05），而CIMF組中基因突變型患者與野生型患者的年齡無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。JAK2V617F基因突變在男性發(fā)生率為70.4%，女性發(fā)生率為71.1%，兩者間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1。

表1 JAK2V617F基因突變與患者臨床特征關(guān)系

2.3 JAK2V617F基因突變與患者外周血細胞計數(shù)的關(guān)系 JAK2V617F基因突變型患者的白細胞計數(shù)和血紅蛋白水平在MPN各組中均高于野生型患者（P＜0.05或0.01），但血小板計數(shù)無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表2。

表2 JAK2V617F基因突變與患者外周血細胞計數(shù)間的關(guān)系

3 討論

JAK2是定位于9號染色體短臂2區(qū)4帶（9p24）的胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶（PTK），由7個高度同源結(jié)構(gòu)域JH1～JH7構(gòu)成，與JAK1、JAK3、TYK2同屬于Janus激酶家族[3]。2005年James等[1]率先在PV患者發(fā)現(xiàn)JAK2突變，以后多個研究小組均報道了JAK2V617F的突變。正常情況下，JH2區(qū)域有自我抑制JAK2酪氨酸激酶活性的功能，只有在造血細胞生長因子信號刺激下才使造血細胞增殖分化。所謂JAK2V617F突變指的是JAK2的12號外顯子中1 849位核苷酸G→T突變，導致JAK2蛋白激酶樣區(qū)結(jié)構(gòu)域（JH2）617位的纈氨酸錯義編碼為苯丙氨酸[4]，進而解除了JH2區(qū)域的自我抑制功能，激活JAK2的表達。JAK2的持續(xù)活化，通過JAK-STAT通路傳導至細胞核內(nèi)，促進相關(guān)基因活化，如紅系祖細胞的細胞生存蛋白bcl-x過度表達及紅系祖細胞凋亡減少，或促進造血細胞系的G1/S期活化，伴細胞周期蛋白D上調(diào)和抑制因子p27下調(diào)等，使血細胞大量增殖[1，4]。本文結(jié)果顯示，在MPN患者中JAK2V617F基因突變發(fā)生率為70.7%，其中PV、ET、CIMF、MPN-U 4組JAK2V617F基因突變發(fā)生率分別為90.6%、62.5%、60.9%、60.0%，與國內(nèi)外報道一致[5-6]，對照組則未發(fā)現(xiàn)突變病例。PV患者的突變發(fā)生率高于ET、CIMF及MPN-U，但后3者突變發(fā)生率無統(tǒng)計學差異。2008年，WHO將JAK2V617F列入bcr/abl陰性的PV、ET、CIMF的診斷依據(jù)中，揭示了此基因的重要性，亦為臨床診斷提供了一個重要的依據(jù)，本文結(jié)果也較好揭示了這一點。2008年WHO診斷標準中，由于JAK2V617F基因檢測的出現(xiàn)，血紅蛋白及血小板計數(shù)較以往規(guī)定的指標值有所下降。如果JAK2突變陽性，血紅蛋白升高（男性＞185g/L，女性＞165g/L）及骨髓紅系細胞增生明顯即可診斷PV。即使血紅蛋白低于以往WHO規(guī)定的指標值，但持續(xù)超過正常值20g/L，也可確診為PV。而對于ET，只要具備JAK2突變陽性，血小板持續(xù)＞450×109/L及骨髓巨核細胞增生，即可診斷。所以在臨床上，如果JAK2突變陽性，則可以排除反應(yīng)性紅細胞增多或血小板增多癥。但需注意一部分患者JAK2突變?yōu)殛幮?，需動態(tài)觀察及注意檢測方法的選擇。

JAK2V617F基因突變的檢測方法有直接測序法、PCR技術(shù)等。本研究中應(yīng)用實時熒光PCR法檢測，優(yōu)點為特異性強，自動化程度高。JAK2V617F突變存在純合和雜合兩種類型，James等[1]認為，JAK2V617F突變對MPN的發(fā)生并非必要，在出現(xiàn)臨床癥狀后，突變只是作為一個基因事件與疾病的進展相關(guān)，據(jù)此JAK2V617F突變陰性的MPN患者應(yīng)處于疾病早期階段，若為純合型JAK2V617F突變患者則病程最長，疾病處于較晚期階段，雜合型向純合型轉(zhuǎn)變過程代表著疾病進展[7]。故對突變陰性患者可定期復查JAK2V617F基因突變情況。

本研究還發(fā)現(xiàn)JAK2V617F基因突變型患者的平均年齡高于野生型，但突變發(fā)生率在不同性別比較無統(tǒng)計學差異。Carobbio等[8]報道JAK2V617F基因突變型患者的平均年齡高于野生型，并認為患者年齡＞60歲是影響患者存活時間的不利因素，本文結(jié)果與此報道基本相符。Tefferi[3]認為血白細胞增多對于PV和ET患者的總體生存期及PV的白血病轉(zhuǎn)化都有著重要的預(yù)后價值。在本研究中，JAK2V617F突變陽性者，表現(xiàn)為血白細胞增高，與野生型比較有統(tǒng)計學差異，其表達與預(yù)后的關(guān)系有待進一步追蹤觀察。國內(nèi)晁紅穎等[9]報道JAK2V617F基因突變型患者的血白細胞計數(shù)和血紅蛋白水平高于野生型患者，但血小板計數(shù)無差異。本文報道與此相符，但其相關(guān)性需更大樣本來證實。

JAK2V617F基因突變的發(fā)現(xiàn)將給MPN靶向治療藥物的研制帶來新的方向，如Werning等[10]的研究報道JAK2抑制劑有良好的作用。

綜上所述，JAK2V617F基因突變檢測開展可提高MPN的臨床診斷水平，尤其對早期或不典型的MPN診斷具有重要意義，亦為靶向治療提供了一個很好的思路。

[1]James C,Ugo V,Le Couédic J P,et al．A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythemia vera[J]．Nature,2005,434(7037):1144-1148．

[2]Vardiman J W,Brunning K D,Harris N L．WHO histological classification of chronic myeloproliferative diseases[M]//Jaffe E S,Harris N L,Stein H,et al．World Health Organization Classification of Tumours:Tumours of the Haematopoietic and Lymphoid Tissues．Lyon:International Agency for Research on Cancer(IARC)Press, 2001:17-44．

[3]Tefferi A．JAK2 mutations and clinical practice in myeloproliferative neoplasms[J]．Cancer J,2007,13(6):366-371．

[4]Baxter E J,Scott L M,Campbell P J,et al．Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders[J]．Lancet,2005,365(9464):1054-1061．

[5]買買提力·依馬木,安利,王曉敏,等．骨髓增殖性腫瘤128例JAK2V617基因突變與血栓栓塞關(guān)系的研究[J]．中國實用內(nèi)科雜志,2012,32(5): 363-365．

[6]Scott L M,Tong W,Levine R L,et al．JAK2V617F exon 12 mutation in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis[J]．N Engl J Med, 2007,356(5):459-468．

[7]Kralovics R,Passamonti F,Buser A S,et al．A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloprolifeative disorders[J]．N Engl J Med, 2005,352(17):1779-1790．

[8]Carobbio A,Finazzi G,Guerini V,et al．Leukocytosis is a risk factor for thrombosis in essential thrombocythemia:interaction with treatment,standard risk factors,and Jak2 mutation status[J]．Blood,2007,109(6):2310-2313．

[9]晁紅穎,范崢,張日,等．412例骨髓增殖性腫瘤的JAK2V617F突變檢測及其臨床意義[J]．中華腫瘤學雜志,2009,7(31):510-514．

[10]Werning G,Kharas M G,Okcbe R,et al．Efficacy of TG101348,a selective JAK2 inhibitor intreatment of a murine model of JAK2V617F-induced polycythemia vera[J]．Cancer Cell,2008,13 (4):311-320．

JAK2V617F gene mutation in patients with bcr/abl-negative myeloproliferative neoplasms

Objective To investigate the frequency and clinical implication of JAK2V617F gene mutation in patients with bcr/abl-negative myeloproliferative neoplasms(MPN)．MethodsJAK2V617F mutation was screened by real-time fluorescent PCR in 99 patients with bcr/abl-negative MPN．ResultsJAK2V617F mutation was detected in 70 of 99 patients with MPN,the frequency rate of mutation was 90．6%(29/32)in patients with polycythemia vera(PV),62．5%(15/24)in essential thrombocythemia (ET),60．9%(14/23)in chronic idiopathic myelofibrosis(CIMF)and 60．0%(12/20)in myeloproliferative neoplasma-undifferentiated (MPN-U)．The frequency of JAK2V617F mutation in PV patients was significantly higher than that in ET,CIMF,and MPN-U patients(P＜0．05 or 0．01)．There were significant differences in age,leukocyte counts,and hemoglobin levels between JAK2V617F positive and negative patients(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionJAK2V617F gene mutation is correlated with the classification of MPN,age and blood cells counts．It may be used as a molecular marker for patients with bcr/abl negative MPN．

Myeloproliferative neoplasms JAK2V617F mutation Real-time fluorescent PCR

2014-04-28）

（本文編輯：胥昀）

318050 浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）路橋醫(yī)院血液科