朱丹化 蘇志鵬 陳賢斌 張宇 葉盛 諸葛啟釧

腦出血后顱內(nèi)HO-1的表達(dá)與腦損傷的關(guān)系研究

朱丹化 蘇志鵬 陳賢斌 張宇 葉盛 諸葛啟釧

目的 觀察腦出血患者不同時(shí)間段血腫周圍腦組織血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)趨勢(shì)及其與腦損傷程度之間的關(guān)系。方法收集高血壓腦出血手術(shù)患者皮層腦組織及血腫周圍腦組織標(biāo)本共60例，以免疫組化方法分別測(cè)定HO-1及8-羥基-2-脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）的表達(dá)，分析發(fā)病不同時(shí)間段HO-1表達(dá)與患者腦損傷程度之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)?。?4h及1～3d的患者血腫周圍腦組織HO-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為90．9%和85．7%，8-OHdG的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86．4%和90．5%，與發(fā)?。?d患者比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0．05），而發(fā)?。?4h患者HO-1和8-OHdG陽(yáng)性表達(dá)率與發(fā)病1～3d患者比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0．05）。結(jié)論腦出血后3d內(nèi)血腫周圍腦組織HO-1表達(dá)最強(qiáng)，3d后較前減弱，與腦損傷的程度及治療時(shí)間窗一致。腦出血后3d內(nèi)是手術(shù)及藥物干預(yù)的最佳時(shí)期。

腦出血 血紅素加氧酶-1 8－羥基－2－脫氧鳥(niǎo)苷 免疫組化

腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，在我國(guó)占全部腦卒中的20.0%～30.0%，急性期病死率為30.0%～40.0%。為了降低腦出血的致死率和致殘率，改善患者預(yù)后，近年來(lái)對(duì)于腦出血介導(dǎo)的腦損傷機(jī)制進(jìn)行了很多研究。腦出血后的腦損傷機(jī)制非常復(fù)雜，對(duì)于可能的影響因素如血紅蛋白代謝的起始酶和限速酶如血紅素加氧酶-1（HO-1）等的研究在國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道[1]，但上述研究均為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相關(guān)的臨床研究國(guó)內(nèi)外一直未見(jiàn)報(bào)道。8-羥基-2-脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）是目前公認(rèn)的DNA氧化損傷的標(biāo)志物[2]，本研究以其作為判斷腦損傷程度的標(biāo)志。同時(shí)本研究通過(guò)觀察腦出血患者不同時(shí)間段血腫周圍腦組織HO-1表達(dá)趨勢(shì)及其與腦損傷程度間的關(guān)系，旨在尋找手術(shù)與藥物干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)，改善患者預(yù)后。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2010-10—2013-11我科高血壓腦出血手術(shù)患者皮層及血腫周圍腦組織標(biāo)本共60例，其中男38例，女22例，年齡40～77歲，平均59.25歲。發(fā)病時(shí)間＜24h組患者22例、1～3d組21例；3～7d組11例；＞7d組6例。手術(shù)方式為骨瓣開(kāi)顱血腫清除術(shù)及直切口小骨窗開(kāi)顱血腫清除術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：選取符合全國(guó)第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT檢查證實(shí)有手術(shù)指征的高血壓腦出血患者，出血部位均位于基底核區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有心肌梗死、嚴(yán)重肝腎功能不全、糖尿病、嚴(yán)重周圍血管栓塞性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等其中任一疾病者；（2）發(fā)病前2周或入院時(shí)發(fā)生感染者；（3）服用吲哚美辛等炎癥抑制藥物、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素類藥物等其中任一藥物者；（4）血管畸形、煙霧病等其他血管性疾病患者。

1.2 方法 手術(shù)時(shí)取患者皮層腦組織及血腫周圍腦組織各1塊，其中皮層腦組織作為對(duì)照組，所有標(biāo)本由同一位醫(yī)師獲取。浸泡4.0%多聚甲醛溶液24h，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，切片厚度為4μm，常規(guī)HE染色。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人HO-1抗體購(gòu)于Epitomics公司，Elivision免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于DAKO公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化Elivision兩步法測(cè)定腦組織中HO-1及8-OHdG的表達(dá)，HO-1一抗稀釋比例為1∶150，二抗采用DAKO試劑盒，DAB顯色，以TBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以正常腦組織標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照。測(cè)定8-OHdG時(shí)，以0.01M PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果分析及判定 所有染色標(biāo)本均由2位病理科醫(yī)師雙盲下進(jìn)行評(píng)價(jià)。免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)由每個(gè)切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野獲得，顯色強(qiáng)度數(shù)據(jù)由美國(guó)Media Cybernetics公司Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)軟件自動(dòng)生成。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：以切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)和顯色強(qiáng)度分級(jí)作為標(biāo)準(zhǔn)。顯色強(qiáng)度分級(jí)計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃染色為1分，棕黃色/棕褐色顆粒為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)計(jì)分：0～1.0%為0分，1.0%～10.0%為1分，10.0%～50.0%為2分，50.0%～80.0%為3分，80.0%～ 100.0%為4分。最終評(píng)分=顯色強(qiáng)度分級(jí)計(jì)分×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)計(jì)分。最終評(píng)分3～5分為（+），6～9分為（++），10～12分為（+++），凡（+）或（+）以上者均為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 可見(jiàn)血腫周圍腦組織有不同程度的腦水腫和神經(jīng)元受損現(xiàn)象，表現(xiàn)為神經(jīng)元和小血管周圍空隙，細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)邊集和核碎裂、溶解，見(jiàn)圖1。

2.2 患者腦組織的HO-1表達(dá) HO-1在對(duì)照組皮層腦組織的陽(yáng)性表達(dá)率為20.0%（4/20），而血腫周圍腦組織陽(yáng)性表達(dá)率在＜24h組患者為90.9%（20/22）、1～3d組為85.7%（18/21）、3～7d組為45.5%（5/11）及＞7d組為50.0%（3/6），各組與對(duì)照組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；＜24h組與1～3d組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但與3～7d組及＞7d組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見(jiàn)圖2及表1。

2.3 患者腦組織的8-OHdG表達(dá) 8-OHdG在對(duì)照組皮層腦組織的陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%（8/20），而血腫周圍腦組織陽(yáng)性表達(dá)率在＜24h組患者為86.4%（19/22）、1～3d組為90.5%（19/21）、3～7d組為54.5%（6/11）及＞7d組為66.7%（4/6），各組與對(duì)照組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；＜24h組與1～3d組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但與3～7d組及＞7d組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見(jiàn)圖3及表1。

圖1 患者腦組織標(biāo)本病理切片（A：對(duì)照組皮層腦組織；B～E：血腫周圍腦組織有不同程度的腦水腫和神經(jīng)元受損現(xiàn)象，表現(xiàn)為神經(jīng)元和小血管周圍空隙，細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)邊集和核碎裂、溶解；HE染色，×400）

圖2 患者腦組織中HO-1的表達(dá)（A：對(duì)照組皮層腦組織HO-1表達(dá)陰性；B～C：＜24h組和1～3d組血腫周圍腦組織HO-1較多陽(yáng)性表達(dá)；D～E：3～7d組和＞7d組血腫周圍腦組織HO-1少量陽(yáng)性表達(dá)；免疫組化Elivision兩步法，×400）

3 討論

腦出血又稱腦溢血，是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的自發(fā)性出血，其病因多樣，絕大多數(shù)是由于高血壓小動(dòng)脈硬化的血管破裂引起，故也稱高血壓性腦出血。腦出血是中老年人常見(jiàn)的急性腦血管病，病死率和致殘率很高，是腦血管疾病中病死率最高的臨床類型。

研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后血凝塊中紅細(xì)胞的分解產(chǎn)物和分解過(guò)程與腦組織損傷有密切關(guān)系。紅細(xì)胞溶解釋放出血紅蛋白并降解為血紅素，血紅素經(jīng)過(guò)HO-1分解后產(chǎn)生膽綠素、一氧化碳和鐵[3]。HO-1是催化血紅素分解的起始酶和限速酶，是一種應(yīng)激蛋白，在人體發(fā)熱、腦出血及缺血、缺氧等應(yīng)激情況下，可被誘導(dǎo)產(chǎn)生，其表達(dá)也是引起腦出血后腦損傷的重要原因之一[4]。

關(guān)于腦出血后HO-1的表達(dá)變化趨勢(shì)及與腦損傷的關(guān)系，許多學(xué)者進(jìn)行了大量研究。孟慶偉等[5]制作大鼠腦出血模型，發(fā)現(xiàn)血腫周圍腦組織中HO-1的表達(dá)在24h顯著增多，48～72 h達(dá)到高峰，之后逐漸下降。而Gong等[6]研究發(fā)現(xiàn)在腦出血模型大鼠腹腔內(nèi)注射HO-1抑制劑原卟啉（SnPP），可使腦出血后腦水腫明顯減輕。楊奎等[7]采用自體血注射制作大鼠腦出血模型，以藥物梔子總環(huán)烯醚萜苷進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可以抑制腦出血后HO-1表達(dá)并減輕腦水腫。這些都間接證明腦出血后HO-1的表達(dá)與腦水腫有密切關(guān)系。但上述實(shí)驗(yàn)均在動(dòng)物模型階段，尚未取得人體內(nèi)環(huán)境下的直接證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以不同發(fā)病時(shí)間有手術(shù)指征的腦出血患者的腦組織作為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組化測(cè)定并評(píng)估腦組織HO-1和8-OHdG陽(yáng)性表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)發(fā)?。?4h組和1～3d組的患者血腫周圍腦組織HO-1和8-OHdG的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于發(fā)?。?d的兩組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而發(fā)病＜24h組和1～3d組患者的組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明腦出血后3d內(nèi)血腫周圍腦組織HO-1表達(dá)升到最高峰，并與腦損傷的程度同步。本研究結(jié)論系在人體內(nèi)環(huán)境下獲取標(biāo)本得出的，并與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，可為以后臨床干預(yù)提供偱證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦出血后3d內(nèi)HO-1表達(dá)最強(qiáng)，同時(shí)腦損傷的程度最強(qiáng)，3d后較前減弱，表明腦出血后3d內(nèi)是HO-1抑制劑用藥及手術(shù)干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)，積極干預(yù)可以減輕腦出血后腦損傷程度，從而改善患者的神經(jīng)功能預(yù)后。

圖3 患者腦組織中8-OHdG的表達(dá)（A：對(duì)照組皮層腦組織8-OHdG表達(dá)陰性；B～C：＜24h組和1～3d組血腫周圍腦組織8-OHdG較多陽(yáng)性表達(dá)；D～E：3～7d組和＞7d組血腫周圍腦組織8-OHdG少量陽(yáng)性表達(dá)；免疫組化Elivision兩步法，×400）

表1 不同時(shí)間段各組腦組織HO-1和8-OHdG表達(dá)的結(jié)果（例）

[1]Wang J,Doré S．Inflammation after intracerebral hemorrhage [J]．J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(5):894-908．

[2]高玉楠,楊靖,宋沁馨,等．8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷作為DNA氧化損傷標(biāo)志物在疾病診斷中的應(yīng)用[J]．藥物與醫(yī)學(xué),2012,17(6):223-227．

[3]Ewing J F,Maines M D．Regulation and expression of heme oxygenase enzymes in aged-rat brain:age related depression in HO-1 and HO-2 expression and altered stress-response[J]．J Neural Transm,2006,113(4):439-454．

[4]Soares M P,Bach F H．Heme oxygenase-1:from biology to therapeutic potential[J]．Trends Mol Med,2009,15(2):50-58．

[5]孟慶偉,郭景紅,吳家冪．紅細(xì)胞致腦出血后血腫周圍腦組織HO-1的表達(dá)[J]．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2004,12(4):360-361．

[6]Gong Y,Tian H,Xi G,et al．Systemic zinc protoporphyrin administration reduces intracerebral hemorrhage-induced brain injury[J]．Acta Neurochir Suppl,2006,96(2):232-236．

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Relationship between intracranial HO-1 expression and brain injury after cerebral hemorrhage

Objective To investigate the expression of heme Oxygenase-1(HO-1)in brain tissue its relation to brain injury after cerebral hemorrhage．MethodsCerebral tissue samples round hematoma were collected during surgery from 60 patients with hypertensive cerebral hemorrhage admitted during October 2010 to November 2013．The expression of HO-1 and 8-hydroxy-2-deoxyguanosine(8-OHdG)in brain tissue was determined immunohistochemically,and the relationship between HO-1 and 8-OHdG was analyzed．ResultsThe expression rate of HO-1 in patients with onset＜24 h and 1～3 d was 90．9% and 85．7%respectively（P＞0．05）;expression rate of 8-OHdG in patients with onset＜24 h and 1～3 d was 86．4%and 90．5% respectively（P＞0．05）．There were significant differences in expression of HO-1 and 8-OHdG between patients with onset＜24 h,1～3d and those with onset＞3d (P＜0．05)．ConclusionHO-1 is highly expressed in brain tissue around hematoma within 3 days after cerebral hemorrhage,indicating the optimal time for surgery and drug intervention．

Cerebral hemorrhage Heme oxygenase-1 8-hydroxy-2-deoxyguanosine Immunohistochemical

2014-05-26）

（本文編輯：胥昀）

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20100359）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科

蘇志鵬，E-mail:zhipengsu@gmail.com