蘇士文 趙紫婷 程哲

●臨床研究

正畸力作用下大鼠牙髓組織中熱休克蛋白70的表達(dá)及意義

蘇士文 趙紫婷 程哲

目的 檢測(cè)正畸力作用下大鼠牙髓組織中熱休克蛋白70（Hsp70）的表達(dá)和分布，探討其在正畸移動(dòng)中的作用和機(jī)制。方法建立大鼠正畸牙移動(dòng)模型，分別在受力1、15、30d處死，制備左側(cè)上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨的石蠟標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠正畸牙移動(dòng)過程中牙髓組織中Hsp70的表達(dá)情況。結(jié)果正常對(duì)照組、正畸加力1d組、正畸加力15d組和正畸加力30d組牙髓組織中Hsp70表達(dá)量分別為4．02±0．03、28．13±0．23、10．02±0．08、5．23±0．42，正畸加力1d組大白鼠牙髓組織中Hsp70表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0．01），正畸加力15d組和正畸加力30d組與正常對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論Hsp70參與了正畸牙移動(dòng)，并且保護(hù)了牙髓組織。

熱休克蛋白70 免疫組化 正畸力

熱休克蛋白（Hsp）又稱應(yīng)激蛋白，是普遍存在于生物體細(xì)胞中在熱休克狀態(tài)下啟動(dòng)的一系列特殊基因編碼合成的蛋白質(zhì)。其中Hsp70有兩種同源體：Hsc70和Hsp70，Hsc70在正常牙髓組織中即有表達(dá)稱為結(jié)構(gòu)型，而Hsp70在應(yīng)激狀態(tài)下才有表達(dá)又稱誘導(dǎo)型，也是口腔醫(yī)學(xué)中關(guān)于牙髓損傷修復(fù)極為重要的一種Hsp。正畸治療初期很多患者會(huì)出現(xiàn)疼痛不適癥狀，嚴(yán)重者影響進(jìn)食和情緒，甚至?xí)霈F(xiàn)敏感的牙體冷熱反應(yīng)及咬合痛等而終止治療。目前，關(guān)于正畸力對(duì)牙齒的影響也僅局限于對(duì)牙周組織的研究，正畸力對(duì)牙髓組織的影響罕有報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察Hsp70在正畸力作用下不同時(shí)段其在牙髓組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及定位情況，旨在探討正畸力作用下Hsp70在牙髓抗損傷作用中的表達(dá)及意義。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：48只6周齡SPF級(jí)（無特定病原體動(dòng)物）健康雄性Wistar大白鼠，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，體重（220±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。試劑：鼠抗人Hsp70單克隆抗體，二步法免疫組化試劑盒（A瓶：Chem-Mate EnVision+/HRP，兔/小鼠；月瓶：DA月緩沖稀釋液；C瓶：DA月原液），均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及造模 將48只大白鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、正畸加力1d組、正畸加力15d組和正畸加力30d組。采用加力方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組大白鼠左側(cè)上頜第一磨牙施以0.49N近中向正畸力，建立正畸牙移動(dòng)的模型。正常對(duì)照組左側(cè)上頜第一磨牙只安裝加力裝置而不施加力作用。觀察比較4組大白鼠受力后變化。所有動(dòng)物分別在加力后各時(shí)點(diǎn)處死，取含左側(cè)上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊，放入10%甲醛溶液中4℃固定24h，脫鈣、脫水、石蠟包埋。

1.3 免疫組化染色 按試劑盒說明進(jìn)行：常規(guī)脫蠟水化；胰酶法修復(fù)抗原；阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加50～100μl一抗工作液于組織上，室溫孵育30min，用P月S沖洗切片，浸泡5min，重復(fù)3次。取出切片，擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中；滴加50～100μl A液（ChemMateTMEnVision+/HRP）于組織上，室溫孵育30min；滴加預(yù)備好的顯色劑DA月工作液50～100μl，室溫孵育5～10min，或光鏡下控制顯色；顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色；需要時(shí)，蘇木精復(fù)染；脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。

1.4 Hsp70表達(dá)判定及定量分析 Hsp70在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可表達(dá)，出現(xiàn)棕黃色即判定為陽性。免疫組化結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量處理。陽性細(xì)胞百分率＜5%為陰性，6%～30%為弱陽性，31%～60%為陽性，≥60%為強(qiáng)陽性，以陽性和強(qiáng)陽性為過表達(dá)。應(yīng)用MIAS-300全自動(dòng)分析儀，將免疫組化染色的切片在光鏡下統(tǒng)一放大200倍，每張切片上隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞著色的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算機(jī)自動(dòng)測(cè)量陽性細(xì)胞Hsp70的表達(dá)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用PASW statisticsl8統(tǒng)計(jì)軟件，所得計(jì)量資料均采用表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 正常對(duì)照組牙髓組織中個(gè)別牙髓細(xì)胞質(zhì)弱陽性染色，其余未見陽性表達(dá)（圖1）。正畸加力1d，牙髓成牙本質(zhì)細(xì)胞及其相鄰成纖維細(xì)胞為陽性表達(dá)，部分細(xì)胞核著色，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞弱陽性表達(dá)（圖2）。正畸加力15d，牙髓組織中個(gè)別牙髓細(xì)胞質(zhì)弱陽性染色，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞弱陽性表達(dá)（圖3）。正畸加力30d，牙髓組織中個(gè)別牙髓細(xì)胞質(zhì)弱陽性染色，其余未見陽性表達(dá)（圖4）。

圖1 正常組牙髓組織（免疫組化染色，×200，下同）

圖2 正畸力1d牙髓組織

圖3 正畸力15d牙髓組織

圖4 正畸力30d牙髓組織

2.2 各組大白鼠牙髓組織中Hsp70表達(dá)量的比較 正常對(duì)照組、正畸加力1d組、正畸加力15d組和正畸加力30d組牙髓組織中Hsp70表達(dá)量分別為4.02±0.03、28.13±0.23、10.02±0.08、5.23±0.42，正畸加力1d組大白鼠牙髓組織中Hsp70表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），正畸加力15d組和正畸加力30d組與正常對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

Hsps作為一種非特異性的細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白，Hsp70是其中最主要的一種，其重要的功能是參與耐受的形成。當(dāng)細(xì)胞或組織受到應(yīng)激時(shí)，Hsp70生成顯著增加，避免機(jī)體再次應(yīng)激時(shí)遭受更為嚴(yán)重的損傷[1]。90年代初Sens等即已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsp在牙髓中表達(dá)，之后呂平等[2]報(bào)道了Hsp70在齲病中的表達(dá)，而趙紫婷等[3-4]也報(bào)道了Hsp在大鼠及人急慢性牙髓炎中的表達(dá)。另外，筆者的前期研究也發(fā)現(xiàn)人牙髓在正畸力作用下Hsp的表達(dá)[5]。

Hsp70作為分子伴侶的主要功能是清除細(xì)胞內(nèi)積聚的異常蛋白，當(dāng)牙體組織受到外界有害因素的不斷刺激后，成牙本質(zhì)細(xì)胞即會(huì)受到不同程度的損害，使細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成受到影響，導(dǎo)致大量異常折疊的蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚[6]。這些異常的蛋白可能即是引起熱休克反應(yīng)的發(fā)起點(diǎn)，促使牙齒硬組織在受到程度不同的正畸力后，使牙髓組織合成更多的Hsp70與積聚的異常蛋白相互作用將其清除。

本研究結(jié)果顯示，在大鼠磨牙受正畸力1d后，牙髓組織中出現(xiàn)Hsp70的陽性表達(dá)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在正畸力加力1d后Hsp70表達(dá)量達(dá)高峰，此時(shí)可以看到中性粒細(xì)胞呈陽性表達(dá)。在大鼠磨牙受正畸力15d后，牙髓組織中出現(xiàn)Hsp70的弱陽性表達(dá)，可能是細(xì)胞受到正畸力后期，大量的異常蛋白引起機(jī)體內(nèi)Hsp70合成的大量增加。隨著正畸力的逐漸減退，細(xì)胞內(nèi)異常蛋白的積累減少，牙髓細(xì)胞感受到這種變化，逐漸減少Hsp70的表達(dá)水平。此后，隨著牙髓組織內(nèi)異常蛋白的清除，Hsp70的表達(dá)逐漸減少。至正畸加力30d后，胞核和胞質(zhì)內(nèi)Hsp70陽性表達(dá)水平趨于一致。這與李曉魯?shù)萚7]報(bào)道的Hsp70被誘導(dǎo)的數(shù)量與其保護(hù)作用的強(qiáng)弱呈正相關(guān)相符。

綜上所述，筆者認(rèn)為Hsp70可能對(duì)反復(fù)刺激組織的存活具有重要意義，有目的的提高組織細(xì)胞Hsp70的表達(dá)水平將可以有效防止機(jī)體再次受到更強(qiáng)刺激時(shí)細(xì)胞功能受到損傷。在口腔正畸力下，應(yīng)用輕力原則，間隔加力時(shí)間最好在1個(gè)月以上，可以有效避免牙周、牙髓組織的損傷。

[1]田鳳契,鄭金平,孫建婭,等．焦化作業(yè)工人淋巴細(xì)胞Hsp70表達(dá)及作用[J]．中國公共衛(wèi)生,2007,23(2):204-205．

[2]呂平,邊專,陳智．熱休克蛋白70在人正常牙和齲壞牙牙髓中的免疫定位[J]．牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,1999,9(4):267-269．

[3] 趙紫婷,王建平,蘇士文,等．大鼠磨牙牙髓組織在不同的機(jī)械刺激后Hsp70的表達(dá)及意義的研究[J]．口腔醫(yī)學(xué),2010,30(6):339-342．

[4]趙紫婷,張紀(jì)綱,李瑩．熱休克蛋白70在人炎型牙髓組織中的表達(dá)及意義[J]．浙江醫(yī)學(xué),2010,32(6):940-942．

[5]蘇士文．LF托槽在活髓牙排齊過程中對(duì)牙髓組織的影響[J]．口腔醫(yī)學(xué), 2010,30(10):602-604．

[6]Terada K,Mori M．Mitochondrial protein import in animals[J]．Biochim Biophys Acta,1998,14(1):12-17．

[7]李曉魯,彭毅志,袁志強(qiáng),等．熱休克蛋白70基因重組腺病毒載體微膠囊化及口服轉(zhuǎn)染的研究[J]．中華燒傷雜志,2003,19(3):145-147．

Expression of HSP70 in rat molars pulp tissue applied with orthodontic force

Objective To investigate the expression of heat shock protein 70 (Hsp70)in rat molars pulp applied with orthodontic force．MethodsThe animal model for tooth movement was established,and the rats were sacrificed in batches on d1, 15 and 30．The maxillary molars and periodontium specimens were obtained and the expression of Hsp70 was detected by immunohistochemistry．ResultsThe expression of Hsp 70 in control group and d1,d15,d30 orthodontic force groups were 4．02± 0．03 and 28．13±0．23,10．02±0．08,5．23±0．42,respectively．There was significant difference in Hsp 70 expression between control group and D1 orthodontic force group(P＜0．01),while there were no significant differences between control group and D15,D30 groups(P＞0．05)．ConclusionDuring the orthodontic tooth movement,HSP70 might be one of main cytokines in process of reparative dentin mineralization．

Hsp70 Immunohistochemistry Orthodontic force

2013-07-10）

（本文編輯：歐陽卿）

麗水市科技局課題（20110414）

323000 麗水市人民醫(yī)院口腔科（蘇士文、程哲）；麗水市中心醫(yī)院口腔科（趙紫婷）