蔡煒龍 汪偉民 潘杰 王雁 許洪寶 馬志紅

siRNA靶向抑制ATDC蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

蔡煒龍 汪偉民 潘杰 王雁 許洪寶 馬志紅

目的 通過比較ataxia-telangiectasia group D complementing gene（ATDC）在永生化胃黏膜細(xì)胞GES與胃癌細(xì)胞系MNK45、AGS中的表達(dá)差異，探討其對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及侵襲能力的影響。方法應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATDC在胃癌細(xì)胞系MKN45、AGS及永生化胃黏膜細(xì)胞系GES表達(dá)差異，利用慢病毒攜帶的siRNA下調(diào)ATDC在MKN45細(xì)胞表達(dá)水平，采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力以及transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果ATDC在人胃癌細(xì)胞系MKN45與AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯高于永生化胃黏膜細(xì)胞GES（均P＜0．05）；轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒后，與Con-MKN45及MKN45比較，Si-MKN45細(xì)胞的表達(dá)水平明顯下降（P＜0．05）；下調(diào)ATDC表達(dá)后MKN45細(xì)胞的生長(zhǎng)能力明顯受到抑制（P＜0．05），S期細(xì)胞明顯減少、增殖指數(shù)克隆形成率及侵襲能力均明顯降低（均P＜0．05）。結(jié)論慢病毒攜帶的siRNA下調(diào)ATDC表達(dá)后能夠抑制胃癌細(xì)胞MKN45的生長(zhǎng)、增殖與侵襲能力，可為胃癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)。

胃癌 ATDC RNA干擾 增殖

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，居腫瘤相關(guān)致死率第二位[1]。由于多數(shù)胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，缺乏有效治療，預(yù)后較差，導(dǎo)致高病死率。因此尋找新的標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)對(duì)于提高胃癌患者治療效果尤為重要。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，ataxia-telangiectasia group D complementing gene（ATDC）在胃癌組織過表達(dá)與其惡性進(jìn)展密切相關(guān)[2]，其可能在胃癌惡性生物學(xué)行為中起著重要作用。ATDC又名TRIM29，定位于人類11q23，編碼588個(gè)氨基酸的蛋白，其在正常胰腺組織呈陰性表達(dá)，但在胰腺癌中高表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌惡性進(jìn)展[3]。本研究通過比較ATDC在永生化胃黏膜細(xì)胞系GES及胃癌細(xì)胞系MKN45、AGS中的表達(dá)差異，并應(yīng)用慢病毒攜帶的siRNA技術(shù)下調(diào)其在胃癌細(xì)胞系表達(dá)后，探討其對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的影響，為胃癌針對(duì)ATDC生物靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 人永生化胃黏膜細(xì)胞株GES及人胃癌細(xì)胞系MKN45、AGS由第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：10%F月S于1640培養(yǎng)液中37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，本研究所用細(xì)胞均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞蛋白檢測(cè) 采用Western blot進(jìn)行檢測(cè)。收集細(xì)胞于細(xì)胞裂解液處理并離心后取上清液，以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。SDS-Page凝膠電泳，20V恒壓轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉室溫封閉1h后，分別孵育一抗ATDC（Abcam；1∶500）與β-actin（Sigma；1∶3 000），4℃過夜，復(fù)溫1h后，用T月S-T清洗3次，6min/次；室溫孵育羊抗鼠二抗（北京中杉公司；1∶2 000）1h，再次T月S-T清洗3次，ECL顯影，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以β-actin為參照，Quantity one軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 慢病毒攜帶的siRNA構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 慢病毒攜帶ATDC siRNA構(gòu)建參照參考文獻(xiàn)[4]所報(bào)道的方法進(jìn)行，以不含有siRNA片段的慢病毒載體為對(duì)照病毒，兩種病毒均帶有綠色熒光蛋白GFP基因片段。轉(zhuǎn)染前1d將MKN45細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板，細(xì)胞融合度為70%時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。去上清液后用1640培養(yǎng)基（不含F(xiàn)月S）清洗細(xì)胞1次后，每空加入2ml不含血清的1640培養(yǎng)基，每空加入各自病毒液5μl，混勻后培養(yǎng)6h，去上清液，加入含10%F月S繼續(xù)培養(yǎng)。48h后熒光顯微鏡觀察帶有綠色熒光細(xì)胞比例，并分別命名為Con-MKN45及Si-MKN45細(xì)胞。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 將Western blot驗(yàn)證的ATDC顯著下調(diào)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞按照1×104/孔接種于96孔板，從接種后第1、2、3、4、5、6、7天MTT法檢測(cè)540nm處吸光度值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)吸光度平均值及標(biāo)準(zhǔn)差繪制曲線，比較各組細(xì)胞生長(zhǎng)差異。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別以200個(gè)/孔密度接種于6孔板內(nèi)，輕搖使其均勻分布，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12d后，P月S沖洗3次后多聚甲醛固定10min，姬姆薩染色20min后清水洗去染液后空氣中干燥。計(jì)數(shù)克隆數(shù)，并按照以下公式計(jì)算：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心（800r/min）后去上清液，P月S清洗2次后收集細(xì)胞，加入已預(yù)冷的70%乙醇4℃冰箱過夜，P月S清洗1次后，加入碘化丙啶染液、Triton X-100及RNaseA，4℃冰箱避光孵育30min上機(jī)檢測(cè)。重復(fù)3次，細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）按照如下公式計(jì)算：PI=（S+G2）/（S+G2+G1）× 100%。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力，采用8μl孔徑的24孔月orden小室（月D公司），加入Matrigel凝膠（月D公司）制成基底膜。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后按 1×105/孔加入200μl無血清的培養(yǎng)基中，下室加入300μl含10%的培養(yǎng)基于孵箱培養(yǎng)24h后，取出小室，棉簽輕擦上室細(xì)胞，P月S洗3次后4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，200倍光鏡下隨即選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)基底膜下室的細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1ATDC蛋白表達(dá)情況 ATDC在胃癌細(xì)胞系MKN45及AGS的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.92±0.03、0.68±0.04，再永生化胃黏膜上皮細(xì)胞系GES的相對(duì)表達(dá)量為0.29± 0.03，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，見圖1）。轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒后，收集Si-MKN45、Con-MKN45及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（MKN45）蛋白，檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con-MKN45及MKN45比較，Si-MKN45細(xì)胞條帶明顯變窄，其相對(duì)表達(dá)量（0.74±0.05、0.73±0.03，0.12±0.03）的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，見圖2）。

圖1 ATDC在胃癌細(xì)胞系MKN45、AGS及永生化胃黏膜細(xì)胞EGS中的表達(dá)情況

圖2 慢病毒攜帶的siRNA顯著下調(diào)ATDC在胃癌細(xì)胞系MKN45中的表達(dá)情況

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)情況 見圖3。

圖3 細(xì)胞生長(zhǎng)情況

由圖3可見，各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第1～3天的生長(zhǎng)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），從第4天起，Si-MKN45細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于Con-MKN45及MKN45細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3平板克隆結(jié)果 MKN45、Con-MKN45及Si-MKN45細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為140.3±7.6、142±2.7、65.3±7.0，克隆形成率分別為35.1%、35.5%、16.6%。Con-MKN45及MKN45細(xì)胞克隆形成率均明顯高于Si-MKN45（均P＜0.05，見圖4）。

圖4 平板克隆結(jié)果

2.4 細(xì)胞周期及增殖情況 見圖5。

圖5 細(xì)胞周期及增殖情況（A為各期細(xì)胞數(shù)的比較，B為3種蛋白PI值的比較）

由圖5可見，MKN45及Con-MKN45的S期分別為45%、46%，均明顯高于Si-MKN45細(xì)胞的S期（20%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；MKN45及Con-MKN45的G1期分別為39%、37%，均明顯低于Si-MKN45細(xì)胞的G1期（63%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。MKN45及Con-MKN45細(xì)胞的PI分別為60、61，均明顯高于Si-MKN45細(xì)胞的PI（36），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.5 細(xì)胞侵襲遷移能力 慢病毒攜帶的siRNA轉(zhuǎn)染后的MKN45細(xì)胞侵襲遷移能力明顯降低（圖6A）；通過計(jì)數(shù)穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，ATDC下調(diào)后MKN45細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)為61±6.8，顯著低于MKN45（198.8±16.1）及 Con-MKN45（205.2±21.6），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，見圖6月）。

3 討論

ATDC又名TRIM29，屬于TRIM家族成員，具有包括RING、月1及月2等保守的結(jié)構(gòu)域[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，TRIM家族蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)惡性增殖[6]。應(yīng)用基因表達(dá)譜技術(shù)已發(fā)現(xiàn) ATDC蛋白在膀胱癌[7]、子宮內(nèi)膜癌[8]等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，近期的研究發(fā)現(xiàn)ATDC在胰腺癌組織及細(xì)胞系表達(dá)增強(qiáng)與其腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)，其通過激活Wnt信號(hào)通路及穩(wěn)定β-catenin來發(fā)揮促癌作用[3]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，ATDC在胃癌組織高表達(dá)與患者惡性進(jìn)展密切相關(guān)[2]，與組織表達(dá)趨勢(shì)相一致。

目前，中晚期胃癌治療效果不佳，基因技術(shù)的出現(xiàn)給胃癌治療帶來新的思路。RNA干擾技術(shù)，利用具有同源性的雙鏈RNA，靶向性結(jié)合目的mRNA，使其降解而達(dá)到基因沉默效果[9]。本研究應(yīng)用慢病毒攜帶ATDC siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至內(nèi)源性ATDC高表達(dá)的胃癌細(xì)胞系MKN45中，western blot驗(yàn)證其成功下調(diào)ATDC在MKN45細(xì)胞中表達(dá)水平，建立穩(wěn)定細(xì)胞模型為研究其對(duì)胃癌惡性生物學(xué)行為研究奠定基礎(chǔ)。

圖6 細(xì)胞侵襲遷移能力（A為3種細(xì)胞transwell實(shí)驗(yàn)遷移至下室情況，B為3種細(xì)胞遷移至下室細(xì)胞數(shù)的比較）

ATDC蛋白表達(dá)降低后細(xì)胞的生長(zhǎng)能力明顯受到抑制，細(xì)胞S期明顯減少，而G1期明顯增多，細(xì)胞PI顯著降低，提示細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，這一現(xiàn)象與ATDC能夠激活Wnt信號(hào)通路及穩(wěn)定β-catenin生物學(xué)功能相一致[3]；也可能是因?yàn)锳TDC能夠與p53結(jié)合，抑制p53活性，調(diào)節(jié)p53相關(guān)基因比如p21及NOXA等導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[10]。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Si-MKN45細(xì)胞克隆形成率顯著降低，提示干擾ATDC后胃癌細(xì)胞的增殖潛能與對(duì)生存環(huán)境適應(yīng)性降低。ATDC能夠影響Tip60蛋白細(xì)胞亞定位，降低其對(duì)p53乙?；饔茫瑢?dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)能力增強(qiáng)[11]，當(dāng)ATDC蛋白被下調(diào)后這一生物學(xué)功能受到抑制，而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)能力下降。另外，transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATDC下調(diào)后胃癌細(xì)胞侵襲能力也明顯受到抑制，而侵襲能力是胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中的重要因素，這一結(jié)果與Kosaka等[12]的研究結(jié)果相一致。由此可見，下調(diào)ATDC后胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為明顯受到抑制，但本實(shí)驗(yàn)基于體外細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，其體內(nèi)效果及分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

總之，ATDC表達(dá)水平下調(diào)后可顯著抑制胃癌細(xì)胞MKN45的生長(zhǎng)、增殖及侵襲能力，針對(duì)ATDC基因RNA干擾靶向技術(shù)，有望成為抑制胃癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。本研究應(yīng)用western blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ATDC在胃癌細(xì)胞系MKN45及AGS中表達(dá)水平顯著高于人永生化胃黏膜細(xì)胞系GES，這些證據(jù)提示ATDC在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，有望成為新的治療靶點(diǎn)。

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Effects of ATDC gene silencing by siRNA on proliferation and migration of gastric cancer cells

ObjectiveTo investigate the effect of ATDC gene silencing by siRNA on the proliferation and migration of gastric cancer cells．MethodsThe expression of ataxia-telangiectasia group D complementing(ATDC)was detected in immortalized gastric mucosal epithelium cell line GES and gastric cancer cell lines MKN45,AGS by Western blot．Lentivirus-mediated siRNA targeting ATDC was transfected into MKN45 cells,and western blot was performed to evaluate the inhibitory effect of siRNA on ATDC expression．The proliferation,cell cycle,growth potentiality and migration of MKN45 cells were evaluated by MTT, plate cloning formation test,flow cytometry and transwell assays,respectively．ResultsThe expression of ATDC was significantly higher in both MKN45 and AGS cells compared with GES cells．Lentivirus-mediated siRNA targeting ATDC markedly repressed the expression of ATDC in MKN45 cells．MTT and plate cloning formation assays showed that down-regulation of ATDC significantly inhibited the proliferation and growth of MKN45 cells(P＜0．05)．Flow cytometry showed that the number of cells transfected with ATDC siRNA had higher G1,lower S phase and lower proliferation index(PI)(P＜0．05)than those of controls．Transwell assays revealed that the migration of cells transfected with ATDC siRNA was significantly deceased compared with controls．ConclusionThe expression of ATDC is increased in gastric cancer cells,and silencing of ATDC significantly suppresses the proliferation and migration of gastric cancer cells,indicating that ATDC may be a novel target for gene therapy of gastric cancer．

Gastric cancer ATDC siRNA Proliferation

2013-06-03）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

313000 湖州市中心醫(yī)院外科（蔡煒龍、汪偉民、潘杰、王雁、許洪寶），中心實(shí)驗(yàn)室（馬志紅）