盧明東 李丕宏 孫維建 黃和 俞耀軍 鄭志強(qiáng)

胃癌組織中水通道蛋白1、微血管密度與細(xì)胞脹亡的關(guān)系及臨床意義

盧明東 李丕宏 孫維建 黃和 俞耀軍 鄭志強(qiáng)

目的 探討胃癌組織中水通道蛋白1（AQP1）、微血管密度（MVD）與細(xì)胞脹亡的關(guān)系及臨床意義。方法采用免疫組化法、蛋白印跡法檢測(cè)55例胃癌、22例胃正常組織中AQP1的表達(dá)，Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞法計(jì)數(shù)MVD，透射電鏡觀測(cè)細(xì)胞脹亡情況。隨訪并分析AQP1與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中存在細(xì)胞脹亡；Ⅲ+Ⅳ臨床分期胃癌組織中的脹亡指數(shù)（OI）高于Ⅰ+Ⅱ臨床分期（P＜0.01）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組OI明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。AQP1表達(dá)強(qiáng)度與MVD呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。在胃癌組織標(biāo)本中，AQP1陽(yáng)性表達(dá)率為58.2%，明顯高于正常胃組織（P＜0.01）。胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組AQP1表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。多因素生存分析顯示AQP1表達(dá)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。結(jié)論細(xì)胞脹亡和AQP1表達(dá)與胃癌的血管生成、生物學(xué)行為密切相關(guān)；AQP1可以作為判斷胃癌預(yù)后的臨床指標(biāo)。

胃癌 水通道蛋白1 微血管密度 細(xì)胞脹亡

腫瘤產(chǎn)生的根本原因是細(xì)胞的不可控制生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡調(diào)控受限。腫瘤細(xì)胞的死亡包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞脹亡[1-2]，兩者均廣泛存在于腫瘤組織和正常組織中。細(xì)胞脹亡是近年來(lái)腫瘤研究方面的一大熱點(diǎn)，目前關(guān)于細(xì)胞脹亡在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。有研究表明，水通道蛋白1（AQP1）在腫瘤細(xì)胞死亡、細(xì)胞遷移和血管新生的發(fā)生中起了重要作用[3]。本研究采用透射電鏡檢測(cè)胃癌細(xì)胞發(fā)生脹亡的情況，免疫組化法、蛋白印跡法檢測(cè)胃癌和胃正常組織中AQP1的表達(dá)、微血管密度（MVD），分析細(xì)胞脹亡與AQP1、MVD的關(guān)系，并探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2009-01—12我院經(jīng)胃癌根治術(shù)切除的原發(fā)性胃癌組織標(biāo)本55例，患者男26例，女29例；年齡30～77歲，平均（58.0±13.5）歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例。胃癌TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期18例，Ⅲ期27例，Ⅳ期5例。所有患者術(shù)前均未行放療、化療及其他抗癌治療。同時(shí)選擇來(lái)源于胃潰瘍邊緣或胃良性腫瘤患者的正常胃組織22例，患者男13例，女9例，年齡29～70歲，平均（52.0±12.6）歲。標(biāo)本采集后置-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 AQP1檢測(cè) （1）AQP1定位：采用免疫組化法（SP染色），AQP1鼠抗（克隆號(hào)H0503，美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品），工作濃度為1∶80，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,無(wú)著色為陰性細(xì)胞。（2）AQP1半定量：采用蛋白印跡（western blot）法，取組織1g加入預(yù)冷的蛋白裂解液5ml，提取總蛋白。取50μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-15%聚丙烯酰胺凝膠電泳（100V，1.5h）。待溴酚藍(lán)進(jìn)入凝膠底部后，將蛋白質(zhì)印跡到硝酸纖維素膜上，用AQP1鼠抗人一抗1∶400和抗β-actin抗體孵育，過(guò)夜，TBST漂洗3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育2h，一抗和二抗均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色，暗室內(nèi)X線底片感光成像，凝膠成像儀分析。

1.2.2 MVD檢測(cè) 采用兔抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原（FⅧ-RA）多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行SP法染色。先在低倍鏡下全面觀察切片以確定腫瘤內(nèi)血管密度最高處，高密度血管多位于腫瘤邊緣，再在高倍鏡下，以與周?chē)[瘤細(xì)胞、微血管和結(jié)締組織成分及其他連接組織成分明顯區(qū)別的任意1個(gè)棕色染色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為1個(gè)血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)。管腔＞8個(gè)紅細(xì)胞、血管環(huán)形肌超過(guò)3層、硬化區(qū)域的血管、腫瘤壞死區(qū)、腫瘤細(xì)胞稀少區(qū)以及良性病變區(qū)的微血管不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)10個(gè)染色最多的視野中微血管數(shù)，取其中最多的3個(gè)視野下的平均數(shù)作為單位面積血管數(shù)，即MVD。

1.2.3 脹亡細(xì)胞檢測(cè) 倒置光學(xué)顯微鏡觀察：將細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔濃度接種于6孔板,培養(yǎng)24h，光鏡下觀察。設(shè)立對(duì)照組。以PBS洗滌3次，1 500r/min離心5min，棄上清液，4℃2%戊二醛固定72h，1%俄酸固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水，浸透包埋聚合，超薄切片，鈾及鉛雙重染色后透射電鏡下觀察。透射電鏡（日立1-7500型）下隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中的脹亡細(xì)胞數(shù),即為該組織的脹亡指數(shù)（oncosis index，OI）。

1.2.4 隨訪 所有患者出院后每6個(gè)月隨訪1次，電話隨訪與門(mén)診隨訪相結(jié)合（個(gè)別患者采用信件隨訪）；隨訪時(shí)間1～60個(gè)月，最后隨訪時(shí)間為2013年5月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件及凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。AQP1表達(dá)與MVD的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)，預(yù)后影響因素的多因素分析采用Cox回歸。

2 結(jié)果

2.1 脹亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 在透射電鏡下觀察癌細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，體積增大，胞質(zhì)空泡化，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密顆粒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，線粒體早期可出現(xiàn)致密化，后期腫脹，絮狀改變或出現(xiàn)高致密顆粒，嵴破壞；細(xì)胞腫脹波及核，核內(nèi)染色質(zhì)分散，凝集在核膜、核仁周?chē)袝r(shí)聚集成團(tuán)塊；胞膜起泡是脹亡早期事件，隨之胞膜通透性增加，胞膜崩解，詳見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌細(xì)胞發(fā)生脹亡（A：細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)空泡化，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密顆粒；B：細(xì)胞腫脹波及核，核內(nèi)染色質(zhì)分散，凝集在核膜、核仁周?chē)?；透射電鏡，×6 000）

2.2 脹亡與臨床病理指標(biāo)關(guān)系 臨床分期Ⅲ+Ⅳ胃癌組織中OI高于Ⅰ+Ⅱ臨床分期（t=8.620，P＜0.01）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組OI明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（t=2.789，P＜0.05）。不同TNM分期、病理類(lèi)型、分化程度、腫瘤位置、腫瘤大小者OI的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

2.3 AQP1表達(dá)與MVD、臨床病理特征的關(guān)系 AQP1主要表達(dá)于癌細(xì)胞及毛細(xì)血管和小血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上（圖2）。55例胃癌組織中32例表達(dá)陽(yáng)性（58.2%），22例胃正常組織中僅有2例（9.1%）表達(dá)陽(yáng)性，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.358，P＜0.01）。胃癌組織中的AQP1表達(dá)水平明顯高于胃正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.691，P＜0.05）。同時(shí)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性和陰性的胃癌組織中，AQP1表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.927，P＜0.05）。不同TNM分期、病理類(lèi)型、分化程度、腫瘤位置、腫瘤大小者AQPI水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見(jiàn)圖3、表1、2。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的MVD為24.11±10.73，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的MVD 9.19±6.45，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.273，P＜0.05）。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，55例淋巴結(jié)陽(yáng)性的胃癌組織標(biāo)本中AQP1陽(yáng)性表達(dá)水平與MVD呈顯著正相關(guān)（r=0.734，P＜0.05）。

圖2 AQP1和MVD在胃癌中的表達(dá)（A：管狀腺，SP染色，×400；B：乳頭狀腺癌，SP染色，×200；C：MVD在胃癌中的表達(dá)，SP染色，×400）

表1 胃癌組織中臨床病理特征與AQP1、OI值的關(guān)系

表2 各組胃組織中AQP1表達(dá)水平的比較

圖3 各組胃組織中AQP1蛋白表達(dá)水平的比較

2.4 MVD、AQP1與細(xì)胞脹亡的關(guān)系 透射電鏡觀察胃癌組織，發(fā)現(xiàn)脹亡細(xì)胞集聚部分的MVD較疏，血供豐富處的脹亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。AQP1陽(yáng)性表達(dá)者OI（0.73±0.39）低于陰性表達(dá)者（1.15±0.56），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.112，P＜0.01）。

2.5 AQP1與預(yù)后 研究結(jié)束共收到53例隨訪資料，其中2例患者死于其他疾病。53例胃癌組織中，AQP1表達(dá)陽(yáng)性30例，其半數(shù)生存期為23個(gè)月，表達(dá)陰性23例，其半數(shù)生存期為54個(gè)月，兩組患者的生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.869，P＜0.05，圖4），提示AQP1的表達(dá)與胃癌患者的生存有關(guān)。浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、AQP1表達(dá)與胃癌根治術(shù)患者的預(yù)后顯著相關(guān)。對(duì)53例胃癌患者的生存資料進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示AQP1表達(dá)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌根治術(shù)患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），詳見(jiàn)表3。

圖4 AQP1表達(dá)陽(yáng)性和陰性胃癌患者的生存曲線

表3 53例胃癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的Cox分析結(jié)果

3 討論

細(xì)胞死亡方式包括：細(xì)胞凋亡和細(xì)胞脹亡[1]。細(xì)胞脹亡和腫瘤的發(fā)生、惡性化或者消退密切相關(guān)[2]。細(xì)胞脹亡與維持機(jī)體平衡、控制細(xì)胞數(shù)量、對(duì)抗異常細(xì)胞增殖等關(guān)系密切[2，4]。如果與此有關(guān)的生理機(jī)制出現(xiàn)異?；蛘哒系K，就有可能發(fā)生腫瘤。應(yīng)用透射電鏡觀察胃癌組織時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞存在細(xì)胞脹亡，說(shuō)明細(xì)胞脹亡在胃癌的發(fā)生、發(fā)展起一定的作用。

AQP是一類(lèi)存在于細(xì)胞膜上的水通透性蛋白，在哺乳動(dòng)物各種組織細(xì)胞中廣泛分布，共13個(gè)成員（AQP0-12），AQP1為其中一員[5-6]。大量研究表明，AQP1在腫瘤細(xì)胞死亡、細(xì)胞遷移和血管新生中發(fā)揮重要作用[3，7-8]。我們前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[9]，AQP1高表達(dá)的癌組織內(nèi)細(xì)胞具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。在本研究中檢測(cè)55例胃癌組織中AQP1的表達(dá)情況，AQP1陽(yáng)性表達(dá)者OI低于陰性表達(dá)者，可能通過(guò)AQP1對(duì)于細(xì)胞脹亡的抑制從而使細(xì)胞主動(dòng)性死亡能力喪失。細(xì)胞脹亡率的下降使得腫瘤細(xì)胞凈生長(zhǎng)率提高，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控和惡性加劇，故認(rèn)為AQP1可以作胃癌預(yù)后的指標(biāo)。

腫瘤血管新生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并受多種活性因子調(diào)控。MVD被認(rèn)為是判斷惡性腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移潛力的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌標(biāo)本中AQP1陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與MVD表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，提示AQP1高表達(dá)可能與胃癌組織中血管生成有關(guān)。同時(shí)，細(xì)胞脹亡的發(fā)生與血液供應(yīng)不足有關(guān)[10]。對(duì)MVD和AQP1的表達(dá)情況與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的過(guò)表達(dá)與較差生物學(xué)行為的胃癌相關(guān)，與細(xì)胞的脹亡存在一定的聯(lián)系。

綜上所述，本課題采用免疫組化法、蛋白印跡法檢測(cè)AQP1的表達(dá)，采用透射電鏡觀測(cè)細(xì)胞脹亡情況，并通過(guò)分析AQP1表達(dá)、MVD與脹亡、臨床病理特征的關(guān)系，初步證實(shí)細(xì)胞脹亡和AQP1表達(dá)與胃癌的血管生成、生物學(xué)行為有一定關(guān)系。但是限于隨訪時(shí)間及病例數(shù)有限，AQP1對(duì)于預(yù)后的指示意義有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本和深入研究才能得到確切的依據(jù)。

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Relationship between AQP-1/MVD and oncosis in gastric carcinoma and its clinical significance

Objective To investigate the relationship of aquaporin-1(AQP1)and microvessel density(MVD)with the oncosis in gastric carcinoma and its clinical significance.MethodsExpression of AQP1 in 55 cases of gastric cancer and 22 cases of normal gastric tissue was examined by immunohistochemical method and Western blot.MVD was examined by immunohistochemical method.Oncosis was observed by transmission electron microscope.Both the expression of AQP1 and MVD were measured by the image analysis．All 55 patients were followed up and the relationship of AQP1 and MVD with patients'survival was analyzed.ResultsOncosis was observed by transmission electron microscopy in tissue specimens of gastric carcinoma. The oncosis index(OI)was decreased with decreasing of clinical staging(P＜0.01)and it was higher in cases with lymph node metastasis than those without(P＜0.05).The expression of AQP1 was positively correlated with MVD(P＜0.05).In gastric cancer tissue,the positive expression rate of AQP1 was 58.2%,significantly higher than that in the normal gastric tissue(P＜0.01).AQP1 was significantly correlated with lymphatic metastasis.Multivariate analysis revealed that AQP1 expression and lymph node metastasis were independent prognostic factors of poor survival(P＜0.05).ConclusionAQP1 may contribute to the progression of gastric cancer by inhabiting oncosis and leading to angiogenesis,and it can be used as an independent prognostic factor for gastric carcinoma．

Gastric cancer AQP-1 Microvesseldensity Oncosis

2013-06-07）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

溫州市科技局對(duì)外合作重大課題（H20080056）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院課題（2013A003）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科

鄭志強(qiáng)，E-mail：fame198288@126.com