閻家駿 沈翀 孫澤宇 任煜 周毅 李俊龍 唐桂良 潘建剛 潘壽華徐國強

尿沉渣2種miRNA檢測在膀胱癌診斷中的應(yīng)用價值

閻家駿 沈翀 孫澤宇 任煜 周毅 李俊龍 唐桂良 潘建剛 潘壽華徐國強

目的 研究膀胱癌患者尿沉渣中miR-142-3p和miR-145-5p差異性表達，為臨床尋找早期膀胱癌腫瘤標志物提供依據(jù)。 方法 搜集51例未接受經(jīng)尿道腫瘤切除術(shù)的早期膀胱癌患者和38例健康對照者的清晨中后段尿液，從尿沉渣中提取RNA，采用miRNA特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測目標miRNA表達水平，分析兩組的受試者工作曲線（ROC），比較miR-142-3p和miR-145-5p及其組合在膀胱癌早期診斷中的價值。 結(jié)果 miRNA-142-3p在早期膀胱癌患者尿沉渣中顯著升高（FC=3．93，P=0．0002，AUC=0．736）。組合測定miR-145-5p/miR-142-3p比值在膀胱癌患者與健康對照者間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0．00004，AUC=0．755）。 結(jié)論 測定尿沉渣中的miR-142-3p能有效發(fā)現(xiàn)早期膀胱癌，而檢測miR-145-5p/miR-142-3p比值的診斷價值更高。

miRNA 膀胱癌 腫瘤標志物

膀胱癌是國內(nèi)人群泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，早期診斷和治療對改善膀胱癌患者的預(yù)后，提高總生存率至關(guān)重要。膀胱鏡是目前常用的膀胱癌檢查手段，作為有創(chuàng)檢查，患者較難接受[1]。近年來醫(yī)學(xué)界開始探索將尿液腫瘤標志物測定用于早期膀胱癌檢測。在眾多腫瘤標志物中，微小RNA（miRNA）類標志物在腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷中的意義已備受基礎(chǔ)研究學(xué)者與臨床醫(yī)師的關(guān)注[2-3]。由于尿沉渣中含有膀胱內(nèi)壁脫落細胞，是特異性檢測膀胱上皮腫瘤的理想來源，已有研究顯示尿沉渣中差異表達的miR-142-3p以及miR-145-5p有望成為新型的膀胱癌腫瘤標志物[4-5]。本研究利用miRNA特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（qPCR）方法測定膀胱癌患者和健康對照者尿沉渣中miR-142-3p和miR-145-5p的表達差異，探討其作為早期膀胱癌診斷標志物的價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集紹興市人民醫(yī)院泌尿外科2013-01—2014-04住院的51例膀胱癌患者的清晨新鮮尿樣，所有患者均未接受經(jīng)尿道腫瘤切除術(shù)（TURBT）且未經(jīng)過放療及化療，其中男40例，女11例，年齡32～82歲，平均（63.85±13.84）歲。病理分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）TNM分期標準確定，T1期40例，T2期4例，T3期7例。以同期在紹興市人民醫(yī)院健康檢查的38例健康體檢者作為對照，其中男22例，女16例，年齡28～75歲，平均（54.87±18.94）歲；均接受影像學(xué)檢查確認，排除膀胱占位性病變。研究方案通過紹興市人民醫(yī)院倫理審查委員會批準，在樣本采集前均征得研究對象同意。

1.2 主要試劑及儀器 檢測反應(yīng)于CFX96 qPCR（Bio-Rad）系統(tǒng)中進行，按mirVana試劑盒說明書提取RNA，利用ND-1000分光光度計測定總RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄酶（RT）M-MLV購自美國Promega公司，特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物及qPCR檢測引物購自廣州市銳博生物科技有限公司，內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，隨機引物、熒光定量SYBR Green Mix、dNTP以及重組RNase抑制劑（RRI）購自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 標本搜集和制備 每例研究對象留取清晨中后段尿液50ml，4℃下500g/min離心10min分離尿沉渣，500μl磷酸鹽緩沖液清洗2次后按mirVana試劑盒說明書提取RNA，RNA提取物在使用前均于-80℃儲存。

1.3.2 miRNA的cDNA合成 將30μl RNA與1μl隨機引物、4μl miRNA特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄混合引物混合，70℃下孵育10min隨即用冰水冷卻。冷卻后加入1μl 10 mM dNTP、10μl RT緩沖液、1μl RRI、1μl M-MLV和2μl RNase-free水，42℃下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60min，70℃下反應(yīng)10min。

1.3.3 miRNA的熒光定量PCR檢測 在八聯(lián)管中加入2μl cDNA、5μl SYBR Green Mix、1μl目標miRNA特異性上、下游檢測引物和1μl水組成10μl反應(yīng)體系。qPCR反應(yīng)過程如下：95℃30s，95℃5s，60℃20s，72℃10s共40個循環(huán)，熔解溫度70～90℃，熔解率1℃/5s。對每個檢測目標設(shè)定相同的循環(huán)閾值（Ct）基線和截點，每份樣品檢測3次。以內(nèi)參RNA U6為miRNA定量參照，2-ΔΔCt法計算各目標miRNA組間變化倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 針對數(shù)據(jù)非正態(tài)分布特性，利用R語言（v3.0.2）環(huán)境中Mann-Whitney U檢驗對結(jié)果進行分析。受試者工作曲線（ROC）分析于MedCalc軟件中完成。

2 結(jié)果

51例膀胱腫瘤患者均接受經(jīng)TURBT，術(shù)后病理診斷為膀胱尿路上皮癌。其中T1期40例，T2期4例，T3期7例，所有患者均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移。38位健康對照者經(jīng)診斷均無泌尿系統(tǒng)疾病。

以U6為內(nèi)參，miRNA特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄qPCR檢測表明膀胱癌患者尿沉渣中的miR-142-3p的表達水平遠高于健康對照者（倍性變化FC=3.93，P=0.0002），而膀胱癌患者的miR-145-5p相比健康對照者有低表達傾向，但尚無統(tǒng)計學(xué)差異（FC=0.59，P=0.056）。

盡管miR-145-5p對于膀胱癌患者的篩查統(tǒng)計置信度不足，但其與miR-142-3p相反的表達趨勢表明它與miR-142-3p有望組合出具有診斷價值的聯(lián)合腫瘤標志物。結(jié)果顯示，膀胱癌患者miR-145-5p/miR-142-3p比值遠低于健康對照者（FC=0.15，P=0.00004）。

由ROC曲線分析2種miRNA及其組合的診斷能力數(shù)據(jù)如圖1所示。若單獨測定miR-142-3p，得出曲線下面積（AUC）為0.736。設(shè)ΔCt[（miR-142-3p-U6）]截點≤12.5，該標記檢測早期膀胱癌的靈敏度為68.63%、特異度76.32%，而miR-145-5p/miR-142-3p的AUC提升至0.755，設(shè)ΔCt[（miR-145-5p）/（miR-142-3p）]-U6截點≥0.664，靈敏度較低（66.67%）但特異度較高（86.84%），詳見圖2，2種標志物及其組合的AUC診斷數(shù)據(jù)見表1。

3 討論

迄今為止，膀胱鏡檢查是膀胱癌診斷和隨訪監(jiān)測的金標準，但由于其屬于有創(chuàng)性檢查，患者依從性較差，而且對早期腫瘤診斷困難，所以在臨床上開展受到了一定限制。近年來，尿液的膀胱癌腫瘤標志物的檢測作為內(nèi)鏡檢查的替代或輔助手段已在臨床泌尿外科領(lǐng)域掀起熱潮。然而，目前美國食品與藥物管理局（USFDA）批準的生物標記物包括膀胱腫瘤抗原（BTA）stat、Trak、核基質(zhì)蛋白22（NMP22）、尿纖維蛋白原降解產(chǎn)物（FDP）和UroVysion熒光原位雜交技術(shù)目前尚無法在臨床廣泛應(yīng)用[6-7]，原因是以上生物標志物和檢測方法都不夠靈敏和穩(wěn)定，無法取代傳統(tǒng)檢測方法[6，8-9]。醫(yī)學(xué)界仍在探索新的腫瘤標志物用于膀胱癌的診斷和監(jiān)測。

圖1 3種miRNA指標檢測早期膀胱癌的ROC曲線

圖2 膀胱癌患者（虛線）及健康對照者（實線）尿液沉渣中3種miRNA指標的ΔCt值

表1 miRNA指標AUC分析數(shù)據(jù)

miRNA是目前腫瘤生物標志物研究的熱點，作為一類內(nèi)源的、非編碼調(diào)控的單鏈RNA，miRNA主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控，對細胞發(fā)育、增殖、變異和死亡有重要影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA具有致癌基因和抑癌基因的作用。此前有研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達與膀胱癌發(fā)病和進展的關(guān)系密切[10-12]。與mRNA相比，miRNA具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐受惡劣的物理化學(xué)條件（如不同pH值、RNase活性）的特點[13]。尿沉渣中的miRNA具有抗降解性，可在室溫下長期儲存甚至可以耐受多次凍融[5]，這些特性使得尿沉渣中的miRNA成為膀胱癌早期診斷標志物的研究新方向。

目前研究顯示尿沉渣miR-142-3p可以作為潛在的膀胱癌新標志物[4]。而miR-145在膀胱癌中表達下調(diào)，同時能抑制膀胱癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[14-16]，但尚不明確尿沉渣中的miR-145能否用于膀胱癌診斷。

與既往研究比較[4]，本研究中膀胱癌患者尿沉渣中的miR-142-3p含量遠高于健康對照者。也有研究指出miR-142在白血病及睪丸癌中也有高表達[17]。此外，miR-142的高表達被視作肺癌診斷標記[18]。但有學(xué)者對睪丸癌和結(jié)腸癌的研究則證明miR-142既可能作為致癌基因，也可能作為抑癌基因[19-20]，而目前對其在膀胱癌發(fā)病機制中起的作用尚不明確。

miR-145在膀胱癌發(fā)病過程中則充當(dāng)抑癌基因的角色。研究顯示miR-145通過抑制癌基因細胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白7（SOCS7）、纖維束蛋白同源物1（FSCN1）和纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1)防止膀胱癌細胞生長和侵襲[15-16，21]。此外，miR-145能夠激活核心結(jié)合因子（CBFB）、神經(jīng)鈣調(diào)蛋白磷酸酶（PPP3CA）和網(wǎng)格蛋白交互子1（CLINT1）從而促使膀胱癌細胞凋亡[14]。盡管既往研究提示尿沉渣中的miR-145-5p有望成為膀胱癌腫瘤標志物[4-5]，但在本研究中發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者miR-145-5p的表達與健康對照者無統(tǒng)計學(xué)差異。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-145-5p/miR-142-3p的表達比值對膀胱癌具有潛在的診斷價值，這在既往研究中尚是首次。

本研究旨在評估新型miRNA標志物對于早期膀胱癌的診斷效能，所以只包含了無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移的患者（以T1期患者為主）。進一步調(diào)查研究目標應(yīng)針對來自多家不同醫(yī)療機構(gòu)的各類疑似膀胱癌患者，并評估這些miRNA的診斷性能，將來也會研究這些標志物在其他類型樣本，如尿液上清液、血清或血漿中的用途。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)提取自尿沉渣的miR-142-3p能有效發(fā)現(xiàn)早期膀胱癌，而miR-145-5p/miR-142-3p組合檢測能提升miR-142-3p的診斷性能，希望將來這些miRNA測定能應(yīng)用于日常的膀胱癌篩查和膀胱癌復(fù)發(fā)監(jiān)測。

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miR-142-3p and miR-145-5p in urine sediment as potential markers for bladder cancer

Objective To investigate the contents of miR-142-3p and miR-145-5p in urine sediment of patients with bladder cancer．Methods Morning mid-stream urine samples were collected from 51 patients with early stage bladder cancer before transurethral resection and 38 healthy controls．RNAs were extracted from urine sediment and targeting miRNAs were quantified by stem-loop qPCR．The area under receiver operating characteristic curve(AUC-ROC)was used to assess the diagnostic value of miRNAs for bladder cancer． Results miR-142-3p in urine sediment was significantly elevated in urinary sediment of bladder cancer patients（FC=3．93,P=0．0002,AUC=0．736）,while the miR-145-5p had a trend of reduction（FC=0．59,P=0．056）．The ratio of miR-145-5p/miR-142-3p was significantly lower in early bladder cancer patients than that in healthy controls（FC=0．15,P=0．00004,AUC=0．755）．Conclusion MiR-142-3p in urine sediment is increased in patients with early bladder cancer,and the ratio of miR-145-5p/miR-142-3p may be used for early detection of bladder cancer．

MiRNA Bladder cancer Tumor biomarker

浙江省科技廳公益技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目（2012C33SA600020）

312000 紹興市人民醫(yī)院、浙江大學(xué)紹興醫(yī)院、紹興文理學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科（閻家駿、沈翀、任煜、周毅、李俊龍、唐桂良、潘建剛、潘壽華、徐國強）；浙江大學(xué)浙江加州國際納米技術(shù)研究院（孫澤宇）

閻家駿，E-mail:amyyjj001@163.com