董岳峰，麻秀芳，李曉艷，張 璐，李小進(jìn)，郭曉鶯

（1.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.武警山西總隊(duì)醫(yī)院，山西 太原 030006）

納豆（natto）[1]是一種日本豆類發(fā)酵食品，是以黃豆為主要原料，蒸煮之后接入納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成，富含鈣、磷、鈉、鉀及各種維生素，營養(yǎng)價(jià)值極高，對骨質(zhì)疏松、心腦血管病和腫瘤等均有一定的預(yù)防作用[2]。納豆含有一種發(fā)酵食品特殊的氨味，不易被國人所接受[3]。本實(shí)驗(yàn)通過在發(fā)酵底物配方中增加含糖量較高的輔料薏米，提高碳氮比來降低游離氨的生成，改善納豆口感[4]。薏米是藥食皆佳的雜糧之一，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、8種氨基酸、亞油酸、維生素、各種微量元素以及薏醇、甾醇等[5]。薏米的糖質(zhì)含量比大豆高，在大豆中加入一定量的薏米后，使糖質(zhì)總量增加，提高納豆發(fā)酵配方中的碳氮比，改善納豆口感，并對薏米納豆的營養(yǎng)成分進(jìn)行綜合分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆、薏米：購于山西省美特好連鎖超市；凝血酶、尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原、考馬斯亮藍(lán)G-250：美國Sigma公司；納豆芽孢桿菌：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS全自動高壓滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HZ-9211K恒溫振蕩器：太倉市科教器材廠；SHP-80生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-501數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華儀器制造有限公司；CJ-1S超凈工作臺：天津泰斯特儀器有限公司；835-50型氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆菌生長曲線測定[6]

取液體培養(yǎng)的納豆芽孢桿菌，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)整納豆芽孢桿菌濃度為1.0×108個(gè)/mL，用無菌移液管準(zhǔn)確量取10 mL接種于裝有90 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃搖床，150 r/min培養(yǎng)，每4 h取樣，平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體濃度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

納豆激酶的纖溶酶活性是通過與尿激酶的活力比較，得到的相當(dāng)于尿激酶的活力單位。酶活力測定參照Astrup法[7]。

1.3.3 納豆激酶活力測定

稱取新鮮薏米納豆5 g加入100 mL無菌去離子水中，充分振蕩，紗布過濾。取濾液10 μL 點(diǎn)樣于纖維蛋白平板，放置10 min，37 ℃保溫18 h，考馬斯亮藍(lán)G-250[8]染色5 min，測定溶圈直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算薏米納豆激酶活力。

1.3.4 薏米納豆發(fā)酵工藝路線

精選黃豆，室溫條件下浸泡4 h，瀝干備用；薏米室溫條件下浸泡2 h，100 ℃糊化15 min，瀝干，薏米黃豆按質(zhì)量比1∶4混合均勻，121 ℃滅菌20 min，冷卻至60 ℃左右時(shí)接種液體納豆菌（菌體濃度1.0×108CFU/mL），37 ℃培養(yǎng)24 h，4 ℃后熟24 h。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

選取薏米黃豆質(zhì)量比2∶8，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間為24 h為基數(shù)，分別改變?nèi)齻€(gè)因素（薏米黃豆質(zhì)量比、接種量、發(fā)酵時(shí)間）中的一個(gè)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。其中薏米黃豆質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5；接種量為3%、4%、5%、6%、7%；發(fā)酵時(shí)間為12 h、18 h、24 h、30 h、36 h。按照1.3.4的步驟進(jìn)行操作，每組試驗(yàn)3個(gè)平行（n=3），分別進(jìn)行感官評價(jià)，并測定納豆菌總數(shù)和納豆激酶酶活。

母親還是不放心，悄悄讓我晚飯后去盯梢。母親知道我膽大心細(xì)，不怕黑，讓我去，母親放心。我感到很自豪，因?yàn)樵谥車l(xiāng)鄰心中，我是一個(gè)渾身充滿野性的頑童，在眾多的兄弟姐妹里，這樣的重任落在了我的身上，陡然覺得自己是一個(gè)大英雄！

1.3.6 薏米納豆發(fā)酵工藝正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以薏米與黃豆質(zhì)量比、接種量和發(fā)酵時(shí)間為主要因素，以感官評價(jià)分值、納豆菌總數(shù)和納豆激酶酶活性及三者的加權(quán)評分為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表選取不同水平進(jìn)行正交優(yōu)化。感官評價(jià)采用雙盲法打分，以表1評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分[9]。

綜合評分=（感官評價(jià)分值/感官評價(jià)最大分值）×100×0.4+（納豆菌總數(shù)/納豆菌總數(shù)最大值）×100×0.3+（納豆激酶活力/納豆激酶活力最大值）×100×0.3。

表1 薏米納豆感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of coixseed-natto

1.3.7 相關(guān)指標(biāo)測定

氨基酸成分測定：參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定方法》[10]；氨基酸態(tài)氮測定：采用甲醛滴定法[11]；總黃酮和多糖含量測定：參照《保健食品功效成分檢測方法》，總黃酮測定采用分光光度法，多糖含量測定采用硫酸蒽酮法[12]；薏米納豆水分測定參照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》采用干燥法測定[13]；總砷測定參照GB/T 5009.11—2003《食品中總砷及無機(jī)砷的測定》[14]；鉛測定參照GB/T 5009.12—2010《食品中鉛的測定》[15]；黃曲霉素B1參照GB/T 5009.22—2003《食品中黃曲霉毒素B1的測定》檢測[16]；糞大腸菌群參照GB 4789.39—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-糞大腸菌群計(jì)數(shù)》[17]檢測，致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌）參照GB 4789.31—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗(yàn)》進(jìn)行檢驗(yàn)[18]。

1.3.8 氨基酸態(tài)氮測定

采用甲醛滴定法[11]。

參照《保健食品功效成分檢測方法》，總黃酮測定采用分光光度法，多糖含量測定采用硫酸-蒽酮法[12]。

1.3.10 薏米納豆理化指標(biāo)和衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)檢測

薏米納豆水分測定參照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》中干燥法測定[13]；總砷測定參照GB/T 5009.11—2003《食品中總砷及無機(jī)砷的測定》[14]；鉛測定參照GB/T 5009.12—2010《食品中鉛的測定》[15]；黃曲霉素B1參照GB/T 5009.22—2003《食品中黃曲霉毒素B1的測定》檢測[16]；糞大腸菌群參照GB 4789.39—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-糞大腸菌群計(jì)數(shù)》[17]檢測；致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌）參照GB 4789.31—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗(yàn)》進(jìn)行檢驗(yàn)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆菌生長曲線測定結(jié)果

圖1 納豆芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus natto

液體培養(yǎng)的納豆芽孢桿菌生長曲線見圖1。由圖1可知，在0～8 h內(nèi)，納豆芽孢桿菌生長速度較慢，處于延滯期；從8 h開始納豆芽孢桿菌生長迅速，進(jìn)入對數(shù)生長期；從20 h開始納豆芽孢桿菌生長變緩，納豆芽孢桿菌數(shù)趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期；從36 h開始納豆芽孢桿菌數(shù)量開始減少，進(jìn)入衰亡期。因此，作為固體培養(yǎng)的種子液選用培養(yǎng)16 h的納豆芽孢桿菌。

2.2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

尿激酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，回歸方程為y=0.039 1x+0.066 1，R2=0.999 5。

圖2 尿激酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of urokinase activity

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果見表2～表4。薏米黃豆質(zhì)量比，接種量和發(fā)酵時(shí)間對薏米納豆的感官評價(jià)、納豆菌總數(shù)和納豆激酶酶活力都有影響，各因素比較適宜的范圍為薏米黃豆質(zhì)量比為1∶9～3∶7，接種量為4%～6%，發(fā)酵時(shí)間為18～30 h。

表2 薏米黃豆質(zhì)量比對試驗(yàn)結(jié)果的影響Table 2 Effect of coixseed and soybean ratio on coixseed-natto quality

表3 接種量對試驗(yàn)結(jié)果的影響Table 3 Effect of inoculum on coixseed-natto quality

表4 發(fā)酵時(shí)間對試驗(yàn)結(jié)果的影響Table 4 Effect of fermentation time on coixseed-natto quality

2.4 薏米納豆發(fā)酵工藝正交優(yōu)化結(jié)果與分析

由表5直觀分析可知，薏米/黃豆質(zhì)量比、接種量、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素對綜合評分的影響順序?yàn)檗裁?黃豆質(zhì)量比＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間，最優(yōu)組合為A2B2C2。即薏米納豆的最佳發(fā)酵工藝為薏米黃豆質(zhì)量比2∶8，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間為24 h。采用此工藝進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)（n=3），薏米納豆的感官評價(jià)分值為96.78±0.45，納豆菌總數(shù)（4.11±0.22）×108CFU/g，納豆激酶活力（1 423±35）IU/g。由表6方差分析可知，薏米/黃豆質(zhì)量比對綜合評分的影響具有顯著性（P＜0.05），接種量和發(fā)酵時(shí)間對試驗(yàn)結(jié)果影響無顯著性（P＞0.05）。

表5 薏米納豆發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and result of orthogonal experiment for fermentation technology optimization

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.5 薏米納豆氨基酸分析結(jié)果

薏米納豆中氨基酸種類豐富，結(jié)果見表7。其中，8種必需氨基酸中除色氨酸外均被檢測到，亮氨酸含量最高，為1.16%，賴氨酸和蘇氨酸含量較低，均為0.62%，必需氨基酸總量為4.81%。非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，為3.31%，其次為天冬氨酸，胱氨酸含量最低，為0.27%，非必需氨基酸總量為9.43%，薏米納豆中的氨基酸總量為14.24%。

表7 薏米納豆的氨基酸組成Table 7 Amino acids compositions of coixseed-natto

2.6 薏米納豆總黃酮、多糖和氨基酸態(tài)氮分析

黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可有效清除體內(nèi)自由基，阻止細(xì)胞的退化、衰老以及癌癥的發(fā)生[19]，薏米納豆總黃酮含量為0.043%。多糖類化合物能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，具有抗病毒和抗腫瘤活性[20]，薏米納豆多糖含量為3.3%。氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，含量越高營養(yǎng)越好，薏米納豆的含量為0.4%。

2.7 薏米納豆理化指標(biāo)和衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)檢測

表8 薏米納豆理化指標(biāo)和衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果Table 8 Physicochemical properties and microbial index of coixseed-natto

3 結(jié)論

薏米納豆的最佳發(fā)酵工藝為薏米黃豆質(zhì)量比2∶8，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間為24 h。薏米納豆氨基酸含量為14.24%，種類豐富，富含黃酮、多糖、氨基酸態(tài)氮等活性成分，理化指標(biāo)及衛(wèi)生指標(biāo)滿足國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。產(chǎn)品氣味芳香，黏液較多，氨基酸成分豐富，感官品質(zhì)良好，口感良好，適合我國人民的飲食習(xí)慣。薏米的糖質(zhì)含量比大豆高，在納豆菌發(fā)酵納豆的過程中，薏米的糖質(zhì)與大豆中較高的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為納豆中碳水化合物，從而減少納豆游離氨的形成改善納豆口感。此外，薏米納豆的開發(fā)為大豆和薏米的深加工及附加值的提高開辟了新途徑，對我國納豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及國民健康發(fā)揮重要作用。

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