孫夢(mèng)桐，臧藝平，繆璐歡，杜靜芳，呂欣然，白鳳翎*

（渤海大學(xué) 化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺(tái)，遼寧 錦州 121013）

隨著生活節(jié)奏的加快，一次性產(chǎn)品大量進(jìn)入人們的日常生活，其中一次性方便筷子是餐飲業(yè)使用最普遍的產(chǎn)品[1]。由于生產(chǎn)廠家的參差不齊，方便筷子的微生物污染問題比較突出[2-5]。一般應(yīng)用于餐具表面檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量的方法為傳統(tǒng)的棉拭子法，表面微生物的檢測(cè)方法與分離微生物的難易程度有關(guān)，同時(shí)還取決于表面的結(jié)構(gòu)及微生物的種類和性質(zhì)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，棉拭子法非常適用于柔軟、粗糙及污染嚴(yán)重的表面[8]。此外，應(yīng)用于表面細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定方法還有接觸平板法、瓊脂注射法、黏性薄膜法、噴霧槍法等[9-13]。這些方法主要是應(yīng)用培養(yǎng)介質(zhì)或載體方式獲取表面微生物，經(jīng)定量稀釋后，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。MOSSEL D A等[14]在檢測(cè)木質(zhì)表面微生物時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)黏性薄膜法比棉拭子法效果差。

本研究以一次性方便筷子為研究對(duì)象，針對(duì)其表面比較堅(jiān)硬、光滑和形狀不規(guī)則的特點(diǎn)，采用直接振蕩法與傳統(tǒng)棉拭子法進(jìn)行分析比較，探討一種更適合檢驗(yàn)不規(guī)則形狀餐具表面的細(xì)菌菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

埃希氏大腸桿菌（Escherichia coliCMCC44102）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuniunsCMCC50115）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCMCC26003）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisACCC11091）：渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。方便筷子：錦州市大潤(rùn)發(fā)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH系列生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MLS-3030CH型立式高壓蒸汽滅菌器：SANYO電機(jī)（廣州）有限公司；IKA Vortex GENIUS3振蕩器：德國IKA公司。

1.3 方法

將埃希氏大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)20 h，用無菌0.85%生理鹽水稀釋至菌濃度約為106CFU/mL。將一次性方便筷子一分為二后，用手術(shù)刀平均切為3段，121 ℃滅菌15 min。將無菌筷子浸泡在約106CFU/mL 4種試驗(yàn)菌株的菌液中，浸泡30 min后無菌條件下晾干，備用。

1.3.1 棉拭子法

用無菌棉拭子擦拭菌液浸泡后方便筷子的表面，每節(jié)筷子用3支棉拭子，反復(fù)擦拭3次，擦拭后置于9 mL滅菌生理鹽水中，在IKA Vortex GENIUS3振蕩器以2 000 r/min分別振蕩4 min、8 min、12 min和16 min，振蕩液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇10-3、10-4和10-5三個(gè)稀釋度，按GB 4789.2—2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》進(jìn)行細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定[15]。

1.3.2 振蕩法

將菌液浸泡后的方便筷子直接置于10 mL滅菌生理鹽水中，在IKA Vortex GENIUS3振蕩器以2 000 r/min分別振蕩4 min、8 min、12 min和16 min，振蕩液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇10-3、10-4和10-5三個(gè)稀釋度，按GB 4789.2—2012進(jìn)行細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定[10]。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異顯著，當(dāng)P＞0.05時(shí)，表示差異不顯著，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

應(yīng)用振蕩法和棉拭子法測(cè)定單支方便筷子表面埃希氏大腸桿菌菌落總數(shù)如圖1所示，由圖1可以看出，振蕩法的檢測(cè)結(jié)果明顯高于棉拭子法，在8 min時(shí)振蕩法與棉拭子法比值為1.25，達(dá)到最高值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在4 min、8 min、12 min和16 min兩種方法具有顯著差異（P=0.013＜0.05）。

圖1 方便筷子表面埃希氏大腸桿菌菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果Fig.1 Results of APC of E.coli on convenient chopsticks surface

圖2是傷寒沙門氏菌菌液浸泡后的單支方便筷子表面經(jīng)振蕩法和棉拭子法測(cè)定的細(xì)菌菌落總數(shù)結(jié)果，從圖2可以得出，振蕩法明顯高于棉拭子法（P=0.022＜0.05）。從振蕩法與棉拭子法兩者的比值來看，在4 min時(shí)最高，到8 min時(shí)變化趨勢(shì)變緩。

圖2 方便筷子表面?zhèn)抽T氏菌菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果Fig.2 Results of APC of S.typhimuniuns on convenient chopsticks surface

對(duì)革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌而言，從圖3和圖4可以看出，從4 min起始至12 min結(jié)束，其振蕩法和棉拭子法兩者的比值呈現(xiàn)先抑后揚(yáng)的走勢(shì)。就振蕩法與棉拭子法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比而言，振蕩法明顯高于棉拭子法，P值分別為0.002和0.006，兩者具有顯著差異。

圖3 方便筷子表面金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果Fig.3 Results of APC of S.aureus on convenient chopsticks surface

圖4 方便筷子表面地衣芽孢桿菌菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果Fig.4 Results of APC of B.licheniformi s on convenient chopsticks surface

表1 振蕩法與棉拭子法數(shù)據(jù)的成對(duì)樣本t 檢驗(yàn)Table 1 Paired samples test of oscillametric method and cotton swab method data

綜合4種供試菌株的兩種檢測(cè)方法的比值，振蕩法明顯高出傳統(tǒng)棉拭子法。且在4 min時(shí)達(dá)到最大值，因此選擇4 min為振蕩時(shí)間。

3 結(jié)論

應(yīng)用振蕩法檢測(cè)筷子細(xì)菌菌落總數(shù)，與傳統(tǒng)的棉拭子法進(jìn)行比較，振蕩法檢測(cè)4種細(xì)菌的測(cè)定結(jié)果平均高出棉拭子法20%以上，兩者具有顯著性差異。在4 min時(shí)振蕩法能檢測(cè)數(shù)量多的細(xì)菌，所以最佳振蕩時(shí)間為4 min。

[1]趙 英，黃力飛，楊大華，等.一次性筷子的細(xì)菌與硫化物含量調(diào)查分析[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，50（8）：94-99.

[2]杜耀武，黃紅瑩，許國強(qiáng)，等.一次性使用筷子的細(xì)菌污染調(diào)查[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（3）：71-72.

[3]陳 瓊，梁洪軍，魏德江，等.某部餐飲單位餐飲具衛(wèi)生監(jiān)測(cè)情況分析[J].東南國防醫(yī)藥，2008，10（4）：316-318.

[4]張志誠，吳 斌，姜國燕，等.深圳市餐具集中消毒單位消毒餐具衛(wèi)生狀況分析[J].中國衛(wèi)生工程學(xué)，2011（3）：238-239.

[5]余曉權(quán)，呂鑫品，程有良.某部隊(duì)食堂餐具的細(xì)菌污染調(diào)查分析[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，12：2319-2320.

[6]GILL C O.Effects on the microbiological condition of product of decontaminating treatments routinely applied to carcasses at beef packingplants[J].Food Prod,2009,72(8):1790-1801.

[7]CLARK D S.Improvement of spray gun method of estimating bacterial populations on surfaces[J].Can J Microbiol,1966,11(6):1021-1022.

[8]KOLLER W.Recovery of test bacteria from surfaces with a simple new swab-rinse technique:A contribution to methods for evaluation of surface disinfectants[J].Zentralblatt für Bakteriologie,1984,179:112-124.

[9]ANGELOTTI R,WILSON J L,LITSKY W,et al.Comparative evaluation of the cotton swab and rodac methods for the recovery ofBacillus subtilisspore contamination from stainless steel surfaces[J].Health Lab Sci,1964,1(4):289-296.

[10]NORTGE G L,SWANEPOEL E,NAUDE R T,et al.Evaluation of three carcass surface microbial sampling techniques[J].J Food Protect,1982,45:1016-1017.

[11]梁 毅，賀 聰.無菌原料藥生產(chǎn)工藝驗(yàn)證過程的研究[J].中國藥房，2012，41：3849-3852.

[12]趙玉明，溫樹田，劉明禮，等.我國首次發(fā)現(xiàn)的暗紋節(jié)菱孢所致皮膚真菌病的毒理實(shí)驗(yàn)及病理分析[J].菌物系統(tǒng)，1997（2）：112-116.

[13]凡雙玉，王佩璋.PVC 薄膜自黏性研究[J].中國塑料，2011（4）：69-72.

[14]MOSSEL D A,KAMPELMACHER E H,VAN NOOREL L M.Verification of adequate sanitation of wooden surfaces used in meat and poultry processing[J].Zentralblatt für Bakteriologie,1966,201(1):91-104.

[15]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2—2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.