呂慧威，胡雪蓮，蔡 勇

（1.吉林師范大學(xué)博達(dá)學(xué)院，吉林 四平 136000；2.四平金士百純生啤酒有限公司，吉林 四平 136001）

隨著消費(fèi)水平的提高，消費(fèi)者的滿足度已經(jīng)不僅停留在啤酒帶來(lái)的口感和視覺(jué)享受，啤酒的生產(chǎn)安全性、產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性越來(lái)越得到關(guān)注。啤酒的貨架期是由其生物穩(wěn)定性、非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性決定的[1]，隨著研究的深入，前兩項(xiàng)已不再是引起啤酒質(zhì)量問(wèn)題的主要原因，科研工作者已把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到啤酒風(fēng)味和口感變化的主要影響因素，人們也正在積極探索導(dǎo)致啤酒風(fēng)味老化的主要原因及防范措施。啤酒老化可以延緩，但不可以杜絕，重點(diǎn)是通過(guò)調(diào)控生產(chǎn)出風(fēng)味穩(wěn)定性高的啤酒，從而延長(zhǎng)啤酒保鮮[2]。為了提高啤酒的抗老化性能，一方面盡可能多地保留一些還原性物質(zhì)到啤酒中去；另一方面要盡可能少的產(chǎn)生老化風(fēng)味的前驅(qū)物質(zhì)[3]。

糖化是制造啤酒的重要環(huán)節(jié)之一，為了提高原料利用率并保證啤酒質(zhì)量，糖化過(guò)程需要較長(zhǎng)時(shí)間地借助于熱的作用，在較高溫度條件下麥汁中的成分會(huì)發(fā)生氧化等反應(yīng)[4]，因此糖化過(guò)程不僅是麥汁產(chǎn)生的過(guò)程，也是啤酒風(fēng)味老化物質(zhì)及其前軀體大量生成的階段[5]，高的熱負(fù)荷意味著啤酒老化的前驅(qū)體物質(zhì)數(shù)量增多，會(huì)給麥汁和啤酒帶來(lái)焦糊口味，不利于啤酒的口味穩(wěn)定性[6]，減少熱負(fù)荷，有利于降低麥汁的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值及老化物的生成[7]。麥汁各階段熱負(fù)荷的增加值主要由溫度和在該溫度條件下的停留時(shí)間所決定[8]。由于回旋槽中溫度相對(duì)較高，而揮發(fā)性弱，分析可能會(huì)造成醛的積累，因而麥汁在回旋槽的停留時(shí)間對(duì)老化羰基化合物的影響值得深入思考[2]。前期有關(guān)學(xué)者已就煮沸階段熱負(fù)荷對(duì)啤酒老化的影響進(jìn)行了深入研究，但回旋沉淀階段的影響鮮為報(bào)道，值得深入研究。反-2壬烯醛（trans-2-nonenal，T2N）的前驅(qū)物就是在糖化過(guò)程中產(chǎn)生的，它是由麥芽中的脂肪酸在酶的作用下形成的，也被視為是原料新鮮度的指示劑[9]，要降低成品啤酒中的T2N，最重要的是減少糖化過(guò)程中T2N及其前驅(qū)物的產(chǎn)生[10]。本研究以TBA值、T2N及其前驅(qū)物等為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了回旋沉淀階段熱負(fù)荷對(duì)麥汁老化的影響，并對(duì)固相微萃取氣質(zhì)法聯(lián)用（solid phase extraction-chromatograph-mass spectrometry，SPME-GC/MS）法檢測(cè)麥汁中反-2壬烯醛（T2N）前驅(qū)體的方法進(jìn)行了優(yōu)化，以期為啤酒生產(chǎn)中糖化階段熱負(fù)荷的控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)麥汁、發(fā)酵液及啤酒：四平金士百純生啤酒有限公司。

反-2-壬烯醛標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇（色譜純）、磷酸（分析純）、NaCl（分析純）：天津市濱海科迪化學(xué)試劑有限公司；高純二氧化碳（純度≥99.5%）：企業(yè)自產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

配有75 μm CAR-PDMS萃取頭的SPME裝置：德國(guó)SIGMA-aldrich公司；Clarus600 GC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子電離源）：美國(guó)PE公司；UGC-12MF氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；FE20型pH計(jì)：瑞士Mettler Toledo集團(tuán)公司；UV1800型分光光度計(jì)：日本島津公司、Vos Rot 90/25型自動(dòng)濁度儀：荷蘭HAFFMANS公司。

1.3 方法

1.3.1 T2N前驅(qū)體檢測(cè)的樣品前處理方法[11-12]

將氮吹儀通入高純二氧化碳，用移液管準(zhǔn)確移取5 mL待測(cè)樣品于22 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl，并用二氧化碳吹走瓶中的空氣，2 min后迅速壓蓋密封，沸水浴中煮沸120 min，再置于50 ℃恒溫水浴中用75 μm CAR/PDMS萃取頭萃取90 min，待檢測(cè)。

1.3.2 儀器分析條件

（1）色譜條件

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（40 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；流速：1 mL/min；升溫程序：柱溫箱起始溫度60 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，保持7 min，以10 ℃/min升至290 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；分流方式：不分流；進(jìn)樣量：1 μL。

（2）質(zhì)譜條件

電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電離電壓70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，測(cè)定模式為選擇離子監(jiān)測(cè)（selected ion monitoring，SIR），溶劑延遲3 min，全掃描質(zhì)核比范圍29～300 u。

1.3.3 檢測(cè)方法

（1）麥汁透光率的檢測(cè)方法

用離心試管量取50 mL麥汁，充分混合均勻后在波長(zhǎng)530 nm條件下檢測(cè)其吸光度值。

（2）麥汁濁度的檢測(cè)方法

（3）T2N前驅(qū)體的檢測(cè)方法

采用SPME-GC/MS方法測(cè)定樣品中的T2N前軀體含量。用保留時(shí)間和離子碎片比例定性，用外標(biāo)法定量，用峰面積計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)樣液中的T2N前軀體含量值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.991～0.998 范圍內(nèi)。

（4）麥汁TBA值的檢測(cè)方法[13-14]

參照參考文獻(xiàn)[13-14]中的分光光度計(jì)法，測(cè)定麥汁TBA值。

（5）麥汁中9種典型老化物質(zhì)的檢測(cè)方法[15]

參照參考文獻(xiàn)[15]中的氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS），測(cè)定麥汁中9種典型老化物質(zhì)（糠醛、2-乙?；秽⒈郊兹?、5-甲基糠醛、苯乙醛、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、煙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯）。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥汁T2N前軀體檢測(cè)方法的優(yōu)化

2.1.1 T2N前軀體的定性定量分析

任何事物與其他事物之間的矛盾，是事物發(fā)展的外部原因。傳統(tǒng)體育各有不同的形式存在，但又有共通相似之處；正因?yàn)檫@些異同，造成了神圣形式上的博弈：

定性分析：用乙醇作溶劑，配制100 μg/mL T2N標(biāo)準(zhǔn)樣品，直接自動(dòng)進(jìn)樣分析，初步確定該物質(zhì)的保留時(shí)間為15.98 min，查看離子碎片發(fā)現(xiàn)各碎片符合該物質(zhì)在譜庫(kù)里的比例。

選擇定量碎片：從NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索T2N的特征離子碎片，含量較高的有41、70、122和140，含量最高的是41，但因?yàn)檫@個(gè)碎片質(zhì)量數(shù)太低，而且大部分化合物都會(huì)有，不具有典型性，掃描后會(huì)有大量其他碎片干擾，出現(xiàn)的峰不是目標(biāo)峰，影響對(duì)結(jié)果的判斷。而其他三個(gè)碎片質(zhì)量數(shù)相對(duì)較高，掃描后匹配度較高。圖1為提取41、70、122和140離子碎片的色譜圖，峰值高度代表其響應(yīng)值強(qiáng)度。由圖1可知，70碎片響應(yīng)值最高。最終確定選擇70、122和140為標(biāo)樣的定性離子碎片，選擇70為定量離子碎片。

圖1 不同選擇離子碎片下的T2N色譜圖Fig.1 T2N chromatogram of different fragments under the selected ion

驗(yàn)證目標(biāo)峰：取10 mL麥汁處理后進(jìn)樣分析，可以檢測(cè)到目標(biāo)峰。為進(jìn)一步驗(yàn)證，在麥汁中加入一定量標(biāo)樣，按照麥汁處理的方法萃取后再次檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)原有的目標(biāo)峰峰面積有所增加，說(shuō)明15.98 min出現(xiàn)的峰就是所要檢測(cè)的目標(biāo)峰。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

麥汁經(jīng)高溫煮沸后的反-2-壬烯醛（T2N）含量可達(dá)200 μg/L，依據(jù)此數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了在麥汁中添加標(biāo)準(zhǔn)品0、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L和400 μg/L，按照樣品的前處理過(guò)程操作并用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC/MS）檢測(cè)其峰面積，結(jié)果扣除空白，分別以各自的峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行回歸計(jì)算，得到回歸方程見(jiàn)表1。

表1 兩根萃取頭T2N的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Table 1 The T2N standard working curve of two extraction fibers

從表1可以看出，兩根萃取頭的檢測(cè)結(jié)果均具有良好的線性關(guān)系，R2均＞0.990，認(rèn)為可以用作結(jié)果的定量分析。

2.1.3 方法重復(fù)性和再現(xiàn)性的驗(yàn)證

表2 兩根萃取頭T2N的重復(fù)性和再現(xiàn)性結(jié)果Table 2 The T2N repeatability and reproducibility of two extraction fibers

經(jīng)過(guò)之前一系列方法優(yōu)化后，檢測(cè)結(jié)果較穩(wěn)定。如表2所示，從第2天的連續(xù)5針結(jié)果可以看出，A萃取頭的單天重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.67%，連續(xù)3 d的再現(xiàn)性為2.22%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于重復(fù)性＜10%，再現(xiàn)性＜15%的要求；B萃取頭較A萃取頭的結(jié)果稍高一些，但也符合要求，說(shuō)明該方法的結(jié)果重現(xiàn)性和再現(xiàn)性符合檢測(cè)要求。

2.1.4 加標(biāo)回收率的測(cè)定

表3 兩根萃取頭T2N的加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3 Adding standard recovery rate of two extraction fibers

在麥汁中分別加入40 μg/L和80 μg/L標(biāo)樣，按照樣品的前處理方法煮沸、萃取、分析，扣除空白后計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，兩個(gè)萃取頭的兩個(gè)不同質(zhì)量濃度加標(biāo)的回收率都在90%～105%，滿足回收率80%～120%的檢測(cè)要求。

結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化的T2N檢測(cè)方法可以作為麥汁老化物質(zhì)反-2-壬烯醛含量的一種可靠的評(píng)價(jià)手段。

2.2 回旋沉淀時(shí)間對(duì)麥汁老化程度的影響

為了驗(yàn)證回旋沉淀時(shí)間對(duì)麥汁老化物質(zhì)的影響，設(shè)計(jì)試驗(yàn)將回旋沉淀時(shí)間由原來(lái)的30 min縮短為25 min和20 min，以T2N和TBA值為指標(biāo)評(píng)價(jià)其差異。試驗(yàn)之前先要以透光率和濁度為指標(biāo)對(duì)麥汁的澄清效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.2.1 麥汁不同冷卻時(shí)間透光率和濁度的差異

為驗(yàn)證回旋沉淀時(shí)間對(duì)麥汁老化程度的影響，需要取樣進(jìn)行T2N和TBA的檢測(cè)，但選取哪個(gè)冷卻時(shí)間的樣品更具有代表性尚不明顯，一鍋麥汁冷卻過(guò)程從開(kāi)始至完畢大約需要60 min左右的時(shí)間，在這區(qū)間選擇哪個(gè)時(shí)間取樣最合適，是不是每批樣品都有這個(gè)趨勢(shì)尚不明確，因此，本輪試驗(yàn)分別取冷卻開(kāi)始、冷卻30 min和冷卻60 min三個(gè)時(shí)間段的麥汁，檢測(cè)透光率和濁度，比較其差異。

圖2 麥汁不同冷卻時(shí)間對(duì)透光率和濁度平均值的影響Fig.2 Effect of different cooling time on average value of wort transmittance and turbidity

分別選取三個(gè)不同品種、不同生產(chǎn)時(shí)間的麥汁樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較其差異。從圖2可以看出，隨著冷卻時(shí)間的延長(zhǎng)，麥汁的濁度平均值逐漸降低，透光率的平均值逐漸升高，說(shuō)明冷卻后期麥汁的澄清效果最好，而且三個(gè)品種麥汁的變化趨勢(shì)完全一致。從圖3可以看出，隨著冷卻時(shí)間的延長(zhǎng)，麥汁的濁度和透光率多次檢測(cè)結(jié)果的RSD都呈逐漸減小的趨勢(shì)，由于品種不同，減小的幅度有所差異，但趨勢(shì)是一致的，說(shuō)明到冷卻的后期不但澄清度高了，而且系統(tǒng)更穩(wěn)定，檢測(cè)的結(jié)果更穩(wěn)定。因此，選擇在冷卻60 min時(shí)取麥汁樣品進(jìn)行分析更具有代表性。

圖3 麥汁不同冷卻時(shí)間對(duì)透光率和濁度RSD的影響Fig.3 Effect of different cooling time on RSD of wort transmittance and turbidity

2.2.2 麥汁不同回旋沉淀時(shí)間透光率和濁度的差異

本試驗(yàn)選取了進(jìn)入同一個(gè)發(fā)酵罐的4鍋麥汁中的后3鍋?zhàn)鳛樵囼?yàn)對(duì)象，保證除了試驗(yàn)因素的不同外，其他條件，包括原輔料、添加劑、生產(chǎn)設(shè)備都是同一批。

表4 不同回旋沉淀時(shí)間對(duì)麥汁透光率和濁度的影響Table 4 Effect of different whirlpool time on wort transmittance and turbidity

3批平行試驗(yàn)的透光率和濁度見(jiàn)表4。比較9批麥汁的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著回旋沉淀時(shí)間的縮短，透光率都有所降低，而濁度呈上升趨勢(shì)，只是變化的幅度有所不同。其中，將回旋沉淀時(shí)間由原來(lái)的30 min縮短至25 min時(shí)，透光率和濁度有輕微變化，透光率增加了2.64%，濁度增加了2.13%，變化幅度非常??；而將回旋沉淀時(shí)間縮短至20 min時(shí)，二者都有較明顯變化，其中，透光率較30 min增加了16.74%，濁度增加了15.65%。結(jié)果表明，將回旋沉淀時(shí)間縮短5 min對(duì)麥汁的濁度影響不大，但縮短10 min將會(huì)明顯影響麥汁的澄清效果，這樣將會(huì)對(duì)后期的過(guò)濾等環(huán)節(jié)產(chǎn)生很大影響。

2.2.3 麥汁不同回旋沉淀時(shí)間T2N和TBA的差異

表5 不同回旋沉淀時(shí)間T2N和TBA比較Table 5 The T2N and TBA in different whirlpool time

3批平行試驗(yàn)的T2N和TBA見(jiàn)表5。比較9批麥汁的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將回旋沉淀時(shí)間由30 min縮短至25 min時(shí)，T2N的含量降低了12.39%，較之前明顯降低，TBA也由0.334降至0.314，降低了5.99%；而從25 min縮短至20 min時(shí)，二者的含量也在呈下降趨勢(shì)，但幅度沒(méi)有那么明顯，T2N和TBA分別降低了1.00%和2.87%。從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)回旋沉淀時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，尤其是＞25 min時(shí)，大大增加了反應(yīng)體系的熱負(fù)荷，導(dǎo)致多種老化物質(zhì)，尤其是醛類物質(zhì)的生成。因此，適當(dāng)降低沉淀靜止時(shí)間，可有效降低老化物質(zhì)及其前軀體的含量，但時(shí)間過(guò)短，沉淀效果不好又對(duì)麥汁的清亮度產(chǎn)生較大影響。因此，將回旋沉淀時(shí)間縮短至25 min既可減少老化物質(zhì)的生成，還能保證麥汁的澄清質(zhì)量。

2.2.4 麥汁不同回旋沉淀時(shí)間9種典型老化物質(zhì)的差異

圖4 麥汁不同回旋沉淀時(shí)間9種典型老化物質(zhì)含量比較Fig.4 The content of 9 kinds of typical aging substance in wort with different whirlpool time

由圖4可知，在檢測(cè)的9種典型老化物質(zhì)中，隨著回旋沉淀時(shí)間的縮短，糠醛的含量有明顯的降低，而其他8種物質(zhì)沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明糠醛受熱負(fù)荷影響最大，在溫度一定的條件下，時(shí)間越短，熱負(fù)荷越小，分析其原因?yàn)?，糠醛是美拉德反?yīng)的產(chǎn)物，該反應(yīng)受熱負(fù)荷影響較大，這也是糠醛常常被作為熱負(fù)荷指示劑的原因，因此，將回旋沉淀時(shí)間縮短至25 min，是在保證麥汁澄清質(zhì)量的基礎(chǔ)上，大大降低老化物質(zhì)含量較有效的方法。

3 結(jié)論

隨著回旋沉淀時(shí)間的縮短，透光率都有所降低，而濁度呈上升趨勢(shì)，將回旋沉淀時(shí)間縮短5 min對(duì)麥汁的濁度影響不大，但縮短10 min將會(huì)明顯影響麥汁的澄清效果。

將回旋沉淀時(shí)間由30 min縮短至25 min和25 min縮短至20 min時(shí)，T2N、TBA和糠醛的含量都有所降低，但縮短5 min的幅度＞10 min，因此，適當(dāng)降低沉淀靜止時(shí)間，可有效降低老化物質(zhì)及其前軀體的含量。

結(jié)果表明，將回旋沉淀時(shí)間縮短至25 min，在保證麥汁澄清質(zhì)量的基礎(chǔ)上可明顯降低老化物質(zhì)含量，大大提高啤酒的抗老化能力。降低回旋沉淀時(shí)間可有效降低麥汁熱負(fù)荷，減少老化物質(zhì)及其前驅(qū)體的生成，降低了潛在隱患，是提高啤酒抗老化能力的有效途徑之一。

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