梁靜波，楊 偉，宋震宇，巢軍委，張景輝，陳冠益

（1.天津大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2.天津生態(tài)城環(huán)保有限公司，天津 300467；3.天津市污染場(chǎng)地治理修復(fù)技術(shù)工程中心，天津 300467）

我國(guó)餐廚垃圾產(chǎn)生量隨著國(guó)民生活水平的提高而持續(xù)增長(zhǎng)，不斷涌出被“垃圾圍城”的城鎮(zhèn)，而餐廚垃圾中含有大量水分，豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，易于被微生物利用，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者在餐廚垃圾資源化方面的廣泛關(guān)注[1-4]。醋糟是食醋固態(tài)發(fā)酵后，通過(guò)固液分離得到的固態(tài)部分，眾多廠家因處理不當(dāng)容易造成環(huán)境污染。雖然醋糟可直接應(yīng)用于禽獸飼料，但是由于其粗纖維含量較高、粗蛋白含量較低，且具有酸味和適口性差的特點(diǎn)，影響了在飼料行業(yè)中的應(yīng)用[5-8]。

為綜合利用餐廚垃圾與醋糟，本試驗(yàn)通過(guò)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法（response surface method，RSM）優(yōu)化微生物固態(tài)混合發(fā)酵餐廚垃圾和醋糟生產(chǎn)蛋白飼料，不但可同時(shí)將餐廚垃圾和醋糟資源化充分利用，挖掘其潛在價(jià)值，而且為緩解我國(guó)飼料資源的不足現(xiàn)狀提供一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

平菇（Pleurotus ostreatus），菌種編號(hào)CICC 14012、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌種編號(hào)CICC 1328、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis），菌種編號(hào)CICC 1314、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），菌種編號(hào)CICC 10071）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

1.1.2 培養(yǎng)基

平菇斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1 L，葡萄糖20 g，瓊脂25 g，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。其中馬鈴薯提取液制備方法為取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0 L。

釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母斜面培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH 7.0～7.2，瓊脂25 g，121 ℃滅菌20 min。

枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，瓊脂25 g，水1 L，121 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：餐廚垃圾與醋糟質(zhì)量比為80∶20，尿素1.0%，MgSO40.4%。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖：天津市北方化玻購(gòu)銷中心；瓊脂、酵母粉、MgSO4：天津市珠江衛(wèi)生材料廠；蛋白胨、牛肉膏：天津市英博生化試劑有限公司；NaCl、尿素：天津化學(xué)試劑二廠；以上化學(xué)試劑均屬于分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-300-GII生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；FA2004電子天平：上海精科儀器有限公司；DGG電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津天宇機(jī)電有限公司；YXQG01高壓蒸汽滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械廠；HYG-II回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；SCD-II型高純水裝置：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料及處理方法

餐廚垃圾由天津生態(tài)城環(huán)保有限公司提供，樣品經(jīng)過(guò)固液分離后，去除餐具、硬骨、廢紙等雜質(zhì)獲得的固態(tài)部分作為本試驗(yàn)發(fā)酵原料；新鮮醋糟市場(chǎng)購(gòu)買。

1.3.2 菌株培養(yǎng)條件

平菇斜面活化培養(yǎng)條件為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間7 d；釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母斜面活化培養(yǎng)條件為32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h；枯草芽孢桿菌斜面活化培養(yǎng)條件為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。

平菇搖瓶種子擴(kuò)大培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間2 d；釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母搖瓶種子擴(kuò)大培養(yǎng)條件為溫度32 ℃、200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間17 h?？莶菅挎邨U菌種子擴(kuò)大培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間10 h。

初始發(fā)酵條件為接種量為10%（其中平菇、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌按等比例混合），發(fā)酵溫度為32 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，每隔12 h進(jìn)行一次翻料。

1.3.3 測(cè)定方法

真蛋白含量測(cè)定方法參見參考文獻(xiàn)[9]，且每個(gè)試驗(yàn)做三次平行得到真蛋白含量平均值。真蛋白含量計(jì)算公式如下：

式中：V2為滴定試樣時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積，mL；V1為滴定空白時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積，mL；C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；m為試樣質(zhì)量，g；0.014為與1.00 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；6.25為氨換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）Plactett-Burman（BP）試驗(yàn)設(shè)計(jì)：選取影響餐廚垃圾和醋糟固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量的六個(gè)因素，分別為發(fā)酵時(shí)間（A）、接種量（B）、餐廚垃圾和醋糟質(zhì)量比（C）、發(fā)酵溫度（D）、MgSO4添加量（E）和尿素添加量（F），設(shè)計(jì)試驗(yàn)次數(shù)N=12的Plactett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)以上所選因素分別進(jìn)行t檢驗(yàn)，由Pr＞|t|值大小判定各因素的顯著水平，該值若＜0.05則表示該因素對(duì)發(fā)酵效果有顯著影響，若＞0.05則證明該因素不顯著[10-11]。

（2）最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)以上PB試驗(yàn)所得到的顯著因素，按照效應(yīng)確定其步長(zhǎng)，而爬坡方向以試驗(yàn)變化的梯度方向?yàn)闇?zhǔn)，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12-13]。

（3）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大真蛋白含量區(qū)和確定試驗(yàn)中心點(diǎn)后，采用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken（BB）設(shè)計(jì)法，建立真蛋白含量與所選顯著因素關(guān)系的多元回歸模型，同時(shí)利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到真蛋白含量最大值以及各因素的最優(yōu)水平，確定優(yōu)化后的發(fā)酵工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plactett-Burman（PB）試驗(yàn)

以發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量作為考察指標(biāo)，利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)影響發(fā)酵效果的幾個(gè)因素進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其結(jié)果見表1。各因素系數(shù)估計(jì)和效價(jià)分析見表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Expermental design and results of Plackett-Burman test

由表2可知，所選各因素對(duì)混合菌種發(fā)酵餐廚垃圾和醋糟產(chǎn)物中真蛋白含量的影響均為正效應(yīng)，其中具有顯著影響的因素為接種量，餐廚垃圾/醋糟和尿素添加量，而發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和MgSO4添加量在所選范圍內(nèi)對(duì)產(chǎn)品真蛋白含量無(wú)顯著影響。通過(guò)發(fā)酵工藝的PB試驗(yàn)可以看出原料配料比對(duì)發(fā)酵效果的影響最大，這可能是由于一般適合微生物生長(zhǎng)的水分含量范圍為65%～70%[14]，而原料配比是在發(fā)酵培養(yǎng)基中餐廚垃圾和醋糟的比例，因?yàn)樵摫壤苯佑绊懓l(fā)酵料的水分含量，對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖有重要影響。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及效應(yīng)分析Table 2 Factors,levels and efficiency evaluation of Plackett-Burman experiment

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

按照PB試驗(yàn)所得到的結(jié)果，選取三個(gè)顯著因素（接種量、原料比和尿素添加量），設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)[15-16]。其余各因素均取初始條件，以發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量作為指標(biāo)，確定各因素最適濃度范圍，結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Experimental design of the steepest ascent

由表3可知，隨著接種量、原料配比和尿素添加量的變化，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為10%，餐廚垃圾和醋糟添加質(zhì)量比為70∶30和尿素添加量為3%時(shí)，真蛋白含量達(dá)到最大值23.82%，因此產(chǎn)物真蛋白含量最大相應(yīng)值在試驗(yàn)號(hào)2和4之間，確定后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)為試驗(yàn)號(hào)3發(fā)酵條件。

2.3 響應(yīng)面法（Box-Behnken Design）優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以接種量、原料比和尿素添加量作為變量以及真蛋白含量（Y）作為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.05b軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken（BB）試驗(yàn)，各因素水平和結(jié)果分別見表4和表5。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平Table 4 Factors and levels of Box-Behnken Design

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Results of Box-Behnken Design for response surface methodology

通過(guò)對(duì)表5中15個(gè)試驗(yàn)組的響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，通過(guò)Design-Expert 8.05b軟件分析得到各試驗(yàn)因素和產(chǎn)物真蛋白含量的函數(shù)關(guān)系為：Y=23.85+0.53X1-0.086X2+0.14X3-0.025X1X2-1.42X1X3+0.99X2X3-1.19X12-0.60X22-2.15X32。

對(duì)回歸方程的方差分析結(jié)果見表6，回歸模型可信度分析結(jié)果見表7。由表6可以看出，回歸方程的F值為24.31，大于F值的概率為0.001 3，說(shuō)明所建立的回歸方程是顯著的。而從表7分析結(jié)果可以看出，該回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.977 7，說(shuō)明所建模型可以很好地反映發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量變化，表明該回歸方程具有良好的擬合度。一般來(lái)說(shuō)，變異系數(shù)的高低可以反應(yīng)模型的可靠性，其值越低說(shuō)明模型越可信，在本試驗(yàn)結(jié)果中變異系數(shù)為1.860 0%，說(shuō)明該模型可信。

表6 回歸方程的方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

表7 模型可信度分析Table 7 Reliability analysis of model

各因素兩兩交互作用對(duì)產(chǎn)品真蛋白含量的影響的響應(yīng)曲面及等高線圖見圖1。由圖1可以看出，真蛋白含量響應(yīng)值存在最大值，進(jìn)一步分析得到當(dāng)X1、X2和X3分別取0.31、-0.14和-0.10時(shí)，即接種量為10.46%、原料質(zhì)量比為67∶33和尿素添加量為2.9%，產(chǎn)物真蛋白含量最高為23.92%，因此該組合為發(fā)酵最優(yōu)工藝。

圖1 接種量、原料比和尿素添加量的交互作用對(duì)真蛋白含量影響的等高線和響應(yīng)面Fig.1 Response surface plots and contour line showing the effect of interactions of inoculum,material ratio and urea addition on true protein content

通過(guò)比較模型優(yōu)化后的發(fā)酵條件下與初始發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量差異，進(jìn)一步考察回歸模型的準(zhǔn)確性和有效性，采用響應(yīng)面模型優(yōu)化工藝得到的產(chǎn)物真蛋白含量平均值為24.04%，與模型預(yù)測(cè)最高值接近，說(shuō)明所建模型具有較高的準(zhǔn)確度。同時(shí)與初始發(fā)酵條件相比發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量提高28.97%。

3 結(jié)論

通過(guò)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面法中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)混合菌種發(fā)酵餐廚垃圾與醋糟生產(chǎn)蛋白飼料發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件為餐廚垃圾和醋糟質(zhì)量比為67∶33，接種量為10.46%（其中平菇、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌按等比例混合），尿素添加量為2.9%，MgSO4添加量為0.4%，發(fā)酵溫度為32 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量最高為24.04%，較初始條件提高28.97%。目前少有同時(shí)利用餐廚垃圾和醋糟兩種有機(jī)廢棄物生產(chǎn)蛋白飼料的報(bào)道，本研究對(duì)餐廚垃圾和醋糟的資源化利用，不但減少環(huán)境污染，而且為有機(jī)廢棄物的綜合利用和補(bǔ)充蛋白飼料資源提供了一條理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

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