陳 永，林良才，肖冬光，田朝光*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

里氏木霉（Trichoderma reesei）是生產(chǎn)纖維素酶的重要工業(yè)菌，具有良好的合成和分泌蛋白能力，已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織、制漿和造紙等行業(yè)用纖維素和半纖維素酶的生產(chǎn)[1-3]。里氏木霉RL-P37菌株是重要的工業(yè)菌株，1983年由Lehigh大學(xué)的學(xué)者[4]誘變獲得，該菌除了比它的親本株Rut NG14的酶活更高之外，更重要特性是可以在大約37 ℃生長(zhǎng)良好，顯著高于其他木霉（30 ℃）。這一特性使其在發(fā)酵過程中顯著的降低能耗，達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目的。此外，該菌對(duì)代謝物阻遏具有抗性，如它可以在玉米釀造酒精的過程中產(chǎn)酶，但不會(huì)被其他的代謝產(chǎn)物（甘油等）所阻遏[4]。有報(bào)道指出，在以5%纖維素（過濾渣BW200）為碳源，添加玉米漿為氮源的情況下發(fā)酵培養(yǎng)，其濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA）（108 IU/h）甚至高于里氏木霉RUT-C30的FPA酶活（87 IU/h），是原始株QM6a的5～6倍[4]。因此，里氏木霉RL-P37是良好的纖維素酶生產(chǎn)和蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的出發(fā)菌株。

在里氏木霉遺傳轉(zhuǎn)化過程中，常用的抗性篩選標(biāo)記有Hygromycin[5]、G418[6]、Bleomycin[7]等，但其數(shù)量有限，并且無(wú)法實(shí)現(xiàn)無(wú)痕操作。然而，營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記可以克服上述的不足[8]。傳統(tǒng)的方法是通過誘變篩選的方法獲得amdS、niaD等營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，其缺點(diǎn)是在誘變的過程中引入了其他突變，不利于后續(xù)的分子改造和機(jī)理研究。本研究用同源重組法獲得了里氏木霉RL-P37的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。該突變體具有潮霉素（hygromycin）和5-氟乳清酸（5-fluorine orotic acid，5-FOA）抗性，同時(shí)其在未添加尿苷（uridine）的基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）上不能生長(zhǎng)。此外，利用來(lái)自于粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）的pyr4基因?qū)ν蛔凅w進(jìn)行了回補(bǔ)，得到了回補(bǔ)菌株CY-1，其在不含尿苷（uridine）的MM培養(yǎng)基上與出發(fā)菌株RL-P37生長(zhǎng)無(wú)顯著差別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

里氏木霉RL-P37：美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心（NRRL-15709）；質(zhì)粒pPK2（含有PgpdA啟動(dòng)子和TtrpC終止子的潮霉素序列）：美國(guó)真菌遺傳保存中心（fungal genetics stock center，F(xiàn)GSC）；大腸桿菌轉(zhuǎn)化用的Trans1-T1 Chemically Competent Cell：北京全式金公司；其他菌株和質(zhì)粒均為本研究構(gòu)建。

1.1.2 試劑和工具酶

用于原生質(zhì)體制備的溶壁酶：美國(guó)Sigma公司；潮霉素（hygromycin）：美國(guó)Amresco公司；pJET1.2/blunt Cloning Vector和EcoRV、XhoI、T4 DNA Ligase等工具酶：美國(guó)Thermo scientific公司；pMD19-T Simple Vector載體：日本TakaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收、DNA純化試劑盒：康為世紀(jì)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L；固體LB培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加15 g/L的瓊脂粉。

里氏木霉RL-P37生孢所用最小必需培養(yǎng)基（minimal essential medium，MEA）：麥芽提取物30 g/L，瓊脂粉15 g/L。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化再生底層培養(yǎng)基是在MEA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1 mol/L的山梨醇（sorbitol）182.17 g/L，121 ℃滅菌20 min。冷卻至室溫后添加2 mg/mL的已過濾尿苷（uridine）、100 μg/mL的潮霉素（hygromycin）；上層培養(yǎng)基是將底層培養(yǎng)基中的瓊脂粉換成7 g/L的瓊脂糖，其他不變。

里氏木霉MM[9]培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，（NH4）2SO45 g/L，KH2PO415 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，CaCl20.6 g/L，MnSO4·H2O 1.6 mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L，CoCl22 mg/L，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.5，115 ℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基添加15 g/L的瓊脂粉。

單胞分離培養(yǎng)基：在MM固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.1%的TritonX-100、2 mg/mL的尿苷（uridine）和100 μg/mL的潮霉素（hygromycin）。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-200B恒溫振蕩培養(yǎng)器：上海智誠(chéng)分析儀器有限公司；DPX-916RB-1 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備公司；Master cycler gradient PCR儀、Concentrator plus 5305真空濃縮儀：德國(guó)Eppendorf公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；BX51熒光電子顯微鏡：奧林巴斯株式會(huì)社；D-63505 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000c核酸蛋白分析儀：美國(guó)Thermo Scientific公司；MiniBeadbea ter-16 21孔珠磨機(jī)：美國(guó)BIOSPEC公司；PB-10 pH計(jì)：賽多利斯（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 里氏木霉的培養(yǎng)和基因組提取

將里氏木霉孢子接種到MEX 斜面上，28 ℃培養(yǎng)10 d。里氏木霉和粗糙脈孢菌基因組的提取參照常規(guī)的絲狀真菌基因組的提取方法[10]。

1.3.2 PCR引物設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

參照J(rèn)EFFREY L等[11]的文獻(xiàn)，查閱美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上木霉pyr4基因和pPK2質(zhì)粒的序列信息，運(yùn)用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物，本研究所用的引物序列見表1。

以pPK2質(zhì)粒為模板，利用引物pGHT-F和pGHT-R擴(kuò)增得到潮霉素抗性表達(dá)元件，將其連到pMD19-TSimpleVector上，得到pGHT載體，如圖2（A）。以1.3.1中提取的木霉RL-P37基因組為模板，利用pyr4-UF、pyr4-UR和pyr4-LF、pyr4-LR分別擴(kuò)增得到pyr4基因上下游同源臂（pyr45'-flank和pyr43'-flank）。將上游同源臂用EcoRV和NotI酶切，并插入pGHT相應(yīng)的酶切位點(diǎn)間，得到pGHT-pyr4U。然后，用PacI和DraI酶切獲得下游同源臂，將其插入pGHT-pyr4U的PacI和HpaI位點(diǎn)間，從而獲得敲除質(zhì)粒pGHT-Δpyr4。本研究中PCR片斷均測(cè)序驗(yàn)證，不再贅述。

根據(jù)FORMENT J V等[12]的文獻(xiàn)，從粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）數(shù)據(jù)庫(kù)中查找粗糙脈孢菌的pyr4基因及其上下游序列，以1.3.1中提取的粗糙脈孢菌基因組為模板擴(kuò)增得到pyr4的表達(dá)元件，并連入到T載體中，得到T-pyr4。用EcoRI 和EcoRV酶切pPK2SurGFP質(zhì)粒[13]，獲得綠色熒光蛋白表達(dá)元件，將其插入到T-pyr4的EcoRI、HpaI酶切位點(diǎn)之間，得到回補(bǔ)質(zhì)粒pNcpyr4-GFP。

1.3.3 原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化參照PENTTILA M等[14]方法。轉(zhuǎn)化完成后將轉(zhuǎn)化液均勻涂布在含有100 μg/mL 潮霉素（hygromycin）、2 mg/mL尿苷（uridine）的再生培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，直到出現(xiàn)可見的轉(zhuǎn)化子，挑選潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子作進(jìn)一步鑒定?；匮a(bǔ)轉(zhuǎn)化時(shí)再生培養(yǎng)基不用添加尿苷（uridine）。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of PCR primers

1.3.4 Southern雜交

參照王關(guān)林等[15]的方法進(jìn)行標(biāo)記，雜交和檢測(cè)步驟按DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II，Roach說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 RL-P37 pyr4基因敲除實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1 RL-P37敲除pyr4基因敲除實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和重要片段獲得Fig.1 pyr4 gene replacement design and obtain of the major fragments

敲除RL-P37pyr4基因流程如圖1（A）所示。以RL-P37基因組DNA為模板，擴(kuò)增木霉pyr4基因的上游、下游同源臂（pyr45'-flank、pyr43'-flank）片段，大小分別為1.5 kbp、1.4 kbp，如圖1（B）所示；以pPK2質(zhì)粒為模板，利用pGHT-F、pGHT-R擴(kuò)增含有g(shù)pdA啟動(dòng)子和trpC終止子的潮霉素序列，大小為2.7 kbp，如圖1（C）所示；以粗糙脈孢菌基因組DNA為模板，利用pyr4-F、pyr4-R擴(kuò)增得到Ncpyr4序列，大小為3 kbp，如圖1（D）所示。

2.2 敲除盒及回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建

參照1.3.2的方法，用EcoRV和NotI酶切2.1中擴(kuò)增出來(lái)的上游同源臂，將其插入pGHT相應(yīng)的酶切位點(diǎn)之間，得到pGHT-pyr4U。然后用PacI和DraI酶切下游同源臂，將其插入pGHT-pyr4U的PacI和HpaI位點(diǎn)間，經(jīng)測(cè)序正確得到敲除盒pGHT-Δpyr4，如圖2（B）所示。以1.3.1中提取的粗糙脈孢菌基因組為模板擴(kuò)增得到pyr4的表達(dá)元件，并連入到T載體中，得到T-pyr4。用EcoRI 和EcoRV酶切pPK2SurGFP質(zhì)粒[13]，獲得綠色熒光蛋白表達(dá)元件，將其插入到T-pyr4的EcoRI、HpaI酶切位點(diǎn)之間，得到回補(bǔ)質(zhì)粒pNcpyr4-GFP，如圖2（C）所示。

2.3 里氏木霉RL-P37 pyr4基因的敲除

將pGHT-Δpyr4敲除盒質(zhì)粒通過原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化RL-P37，在含有尿苷（uridine）和潮霉素（hygromycin）的MEX培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d 后，可見轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子至抗性平板上，在抗性平板上傳代培養(yǎng)3次后進(jìn)行了PCR驗(yàn)證，進(jìn)一步通過單孢分離得到了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，命名為RL-P37Δpyr4，結(jié)果如圖3所示。

圖3 RL-P37Δpyr4轉(zhuǎn)化子的PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoretogram of RL-P37Δpyr4 transformant

2.4 Southern雜交驗(yàn)證RL-P37Δpyr4突變體

圖4 Δpyr4基因敲除突變體Southern雜交分析Fig.4 Southern analysis for the knockout of RL-P37 pyr4 gene

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得的突變株，進(jìn)行了Sourthern雜交分析，以pyr4基因部分上游同源片段為探針，雜交結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在出發(fā)菌株基因組DNA中只有一條1.5 kbp左右的雜交帶，說明pyr4在基因組上為單拷貝。由于用抗性基因hph的表達(dá)元件替換了出發(fā)菌株中的pyr4基因，因而在突變株RL-P37Δpyr4基因組DNA中僅得到一條3.5 kbp左右的雜交帶，也證明了在敲除pyr4基因的同時(shí)沒有發(fā)生隨機(jī)插入。

2.5 RL-P37Δpyr4突變體的回補(bǔ)

圖5 回補(bǔ)菌株的PCR電泳圖Fig.5 PCR electrophoretogram of complement strains

為了驗(yàn)證得到的突變體的表型確是由缺失pyr4引起的，用來(lái)自粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）pyr4基因?qū)Φ玫降耐蛔凅w進(jìn)行了回補(bǔ)。pyr4基因在很多絲狀真菌中有很高的保守性[16]，同時(shí)，利用外源基因?qū)⒉粫?huì)導(dǎo)致其在原位點(diǎn)整合，外源基因的功能也不會(huì)受影響。挑選16株回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子于木霉的MM固體培養(yǎng)基上，從中轉(zhuǎn)接5株生長(zhǎng)比較快的轉(zhuǎn)化子到生孢培養(yǎng)基上，待孢子成熟后提取基因組，用Ncpyr4-F、Ncpyr4-R引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，4～8泳道回補(bǔ)菌株條帶大小與1泳道回補(bǔ)質(zhì)粒的大小相同，而出發(fā)株（2泳道）和陰性對(duì)照（3泳道）并無(wú)目的條帶，初步確認(rèn)得到了回補(bǔ)菌株。

為了進(jìn)一步確認(rèn)回補(bǔ)菌株的表型，同時(shí)對(duì)其中的4號(hào)（現(xiàn)命名為CY-1）和P37Δpyr4進(jìn)行了平板生長(zhǎng)測(cè)試，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在不加尿苷（uridine）的MM培養(yǎng)基上，出發(fā)菌RL-P37和回補(bǔ)菌株CY-1生長(zhǎng)很好，P37Δpyr4不能生長(zhǎng)。此外，為了考察以該營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為出發(fā)菌株表達(dá)外源蛋白的可行性，在回補(bǔ)質(zhì)粒中引入了綠色熒光蛋白表達(dá)元件。結(jié)果顯示，回補(bǔ)菌株CY-1的菌絲中可以觀察到較強(qiáng)的綠色熒光（見圖7），實(shí)現(xiàn)了外源蛋白的高效表達(dá)。

圖6 P37,37Δpyr4,CY-1的MM平板生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)Fig.6 MM plate growth experiment of P37,37Δpyr4,CY-1

圖7 回補(bǔ)菌株CY-1的熒光照片F(xiàn)ig.7 Fluorescent photograph of complement strain CY-1

3 結(jié)論

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)開啟了探索以絲狀真菌作為蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究方向[17]。自發(fā)現(xiàn)以后，由于受專利和技術(shù)等限制，利用分子生物學(xué)手段對(duì)高產(chǎn)菌RL-P37進(jìn)行遺傳改造的文獻(xiàn)報(bào)道較少。隨著其在歐洲和加拿大專利的到期[18]，采用分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行遺傳改造以期獲得能夠用于基因敲除、外源蛋白表達(dá)的底盤菌顯得尤為重要。為此，采用同源重組法成功敲除了里氏木霉高產(chǎn)菌RL-P37的pyr4基因，獲得了純核的、單拷貝插入的突變體，并成功對(duì)其進(jìn)行了回補(bǔ)。該突變體可當(dāng)做其他基因遺傳操作的底盤菌。從該菌出發(fā)，可以構(gòu)建纖維素酶產(chǎn)量進(jìn)一步提高的工程菌或者實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

[1]汪天虹，吳 靜，鄒玉霞.瑞氏木霉分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2000，19（1）：147-152.

[2]CHERRY J R,FIDANTSEF A L.Directed evolution of industrial enzymes:an update[J].Curr Opin Biotech,2003,14(4):438-443.

[3]SALOVUORI I,MAKAROW M,RAUVALA H,et al.Low molecular weight high-mannose type glycans in a secreted protein of the filamentous fungusTrichoderma Reesei[J].Nat Biotechnol,1987,2(5):152-156.

[4]MONTENECOURT B S,BLOOMSBURY N J.Microorganism and process:US,4797361[P].1989-01-10.

[5]MACH R L,SCHINDLER M,KUBICEK C P.Transformation ofTrichoderma reeseibased on hygromycin B resistance using homologous expression signals[J].Curr Genet,1994,25(6):567-570.

[6]GRUBER S,OMANN M,RODR GUEZ C E,et al.Generation ofTrichoderma atroviridemutants with constitutively activated G protein signaling by using geneticin resistance as selection marker[J].BMC Research Notes,2012,5(1):641-648.

[7]RASALA B A,LEE P A,SHEN Z,et al.Robust expression and secretion of xylanase1 inChlamydomonas reinhardtiiby fusion to a selection gene and processing with the FMDV 2A Peptide[J].PLoS ONE,2012,7(8):1-11.

[8]BERGES T,BARREAU C.Isolation of uridine auxotrophs fromTrichoderma reeseiand efficient transformation with the clonedura3andura5genes[J].Curr Genet,1991,19(5):359-365.

[9]ILMEN M,SALOHEIMO A,ONNELA M L,et al.Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungusTrichoderma reesei[J].Appl Environ Microbiol,1997,63(4):1298-1306.

[10]方衛(wèi)國(guó)，楊星勇，張永軍，等.真菌核酸的一種快速提取方法[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2002，8（3）：305-307.

[11]SMITH J L,BAYLISS F T,WARD M.Sequence of the cloned pyr4 gene ofTrichoderma reeseiand its use as a homologous selectable marker for transformation[J].Curr Genet,1997,19(1):27-33.

[12]FORMENT J V,RAMóN D,MACCABE A P.Consecutive gene deletions inAspergillus nidulans:application of the Cre/loxP system[J].Curr Genet,2006,50(3):217-224.

[13]LIAO X,FANG W,LIN L,et al.Metarhizium robertsiiproduces an extracellular invertase(MrINV)that plays a pivotal role in rhizospheric interactions and root colonization[J].PLoS ONE,2013,8(10):1-14.

[14]PENTTILA M,NEVALAINEN H,RATTO M,et al.A versatile transfornation system for the cellulolytic filamentous fungusTrichoderma reesei[J].Gene,1987,61(2):155-164.

[15]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，1998.

[16]BALLANCE D J,TURNER G.Development of a high-frequency transforming vector forAspergillus nidulans[J].Gene,1985,36(3):321-331.

[17]BERKA R M,BARNETT C C.The development of gene expression systems for filamentous fungi[J].Biotechnol Adv,1989,2(7):127-154.

[18]BLAND S.Trichoderma reeseirl-p37 and process:CIPO and espacenet,1227762 A1[P].1987-10-6.