康三江，張永茂，曾朝珍，張海燕，張霽紅，張 芳

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘋果白蘭地是以蘋果汁為原料經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵并蒸餾后得到的一種新型水果類白酒[1]。蘋果白蘭地的揮發(fā)性香氣物質(zhì)是構(gòu)成其質(zhì)量的重要因素，也是評價其內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)，香氣的好壞直接影響著蘋果白蘭地的風(fēng)味品質(zhì)和消費者的選購心理[2]。ZHAO Y P等[3]對白蘭地中的芳香物質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，在鑒定出來的109 種化合物中，最主要的呈香物質(zhì)是酯類物質(zhì)，其中2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、β-大馬酮、反式-β-甲基-γ-辛內(nèi)酯是最重要的呈香化合物。彭松[4]通過對紅棗白蘭地樣品的分析得出，其揮發(fā)性物質(zhì)主要為酯類、醇類、醛類、呋喃類、芳香族類、縮醛類和萜烯類。盧柯等[5]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成荔枝白蘭地香氣特征的物質(zhì)主要是酯類、醇類、酸類、少量的酚類及萜烯類化合物。

氮源是酵母生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，蘋果汁中含有足夠酵母生長所必需的碳水化合物，但其氮的含量較低[6]，氯化銨為酵母發(fā)酵所需的優(yōu)質(zhì)無機氮源物質(zhì)之一。在發(fā)酵中添加適宜的氮源將會有利于酵母的生長及提高蘋果白蘭地的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前就關(guān)于氮源對酵母菌生長及發(fā)酵動力學(xué)研究較多，而蘋果白蘭地中氮源添加對其發(fā)酵揮發(fā)性香氣成分形成的研究報道較少。本試驗在前期優(yōu)化發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上制得蘋果白蘭地，通過頂空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extractions，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatohraph-mass spectrum，GC-MS）法分別測定有無氮源添加蘋果汁中發(fā)酵蘋果白蘭地酒的香氣成分，比較二者異同，揭示氮源對蘋果白蘭地發(fā)酵揮發(fā)性香氣成分的影響，對提高蘋果白蘭地酒的風(fēng)味具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母1023和1620：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；斜面培養(yǎng)基：采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然）；種子培養(yǎng)基：采用PDA液體培養(yǎng)基（裝液量100 mL/250 mL，pH自然）；富士蘋果：采自于甘肅慶陽西峰區(qū)；氯化銨（分析純）：天津奧博凱化工有限公司；焦亞硫酸鈉（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手動固相微萃取（SPME）進(jìn)樣器，100 μm聚二甲基硅烷（polydimethylsilane，PDMS）萃取頭：美國Supelco公司；TRACE DSQ型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Finnigan公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；B204LED型生物顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；TD50002型電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司；Breville-BJE500F型榨汁機：澳大利亞鉑富公司；ZHJH-C11128型超凈工作臺、2WY-2102型恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；RE5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種制備

將釀酒酵母保藏菌種轉(zhuǎn)接于新鮮試管斜面，28 ℃培養(yǎng)48 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。從保存的斜面培養(yǎng)基中用接種環(huán)挑去6環(huán)菌苔接種于裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 蘋果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

在前期優(yōu)化發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上向蘋果白蘭地酒發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加250 mg/L氯化銨作為氮源并設(shè)置對照，分別裝于1 000 mL三角瓶，每瓶600 mL，重復(fù)3次。

1.3.4 蘋果白蘭地酒精發(fā)酵

將活化好的兩種釀酒酵母按照1∶1比例接種于600 mL蘋果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為6%，接種菌含量為106CFU/mL，然后于20 ℃厭氧靜置發(fā)酵6 d。

1.3.5 測定方法

樣品處理：先將SPME萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化1 h，老化溫度250 ℃，取蘋果白蘭地酒8 mL置于15 mL鉗口瓶中，加入2 g氯化鈉，用聚四氟乙烯隔墊密封，放入電子恒溫水浴鍋中加熱30 ℃平衡10 min后，通過隔墊將已老化好的100 μm PDMS萃取纖維頭插在樣品瓶中，保持在30 ℃恒溫頂空吸附40 min后，插入GC-MS進(jìn)樣口，于250 ℃解析5 min。

采用TRACEDSQ型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。

氣相色譜條件：程序升溫，起始溫度45 ℃，保持2.5 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持7 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度230 ℃，載氣氦氣，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣方式。

質(zhì)譜條件：電離方式電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓70 eV，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu，發(fā)射電流100 μA，檢測電壓1.4 kV。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Xcalibur軟件，利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）08標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)圖譜[7]，采用色譜峰面積歸一化法計算出蘋果白蘭地酒中各化學(xué)組分相對質(zhì)量百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果白蘭地GC-MS總離子流色譜圖

采用頂空固相微萃取法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對添加氮源及未添加氮源發(fā)酵蘋果白蘭地酒中的香氣成分進(jìn)行檢測，得到可揮發(fā)性香氣成分的保留時間（retention time，RT）及總離子流圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 添加(A)和未添加(B)氯化銨發(fā)酵蘋果白蘭地中揮發(fā)性成分GC-MS總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of aromatic components in apple brandy with ammonium chloride (A) and without ammonium chloride (B)

2.2 不同處理發(fā)酵蘋果白蘭地香氣成分分析

采用頂空固相微萃取，通過GC-MS對未添加（CK）和添加氯化銨發(fā)酵的蘋果白蘭地中香味物質(zhì)進(jìn)行了分析研究，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，通過GC-MS分析，添加氯化銨發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測得48種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)22種，相對含量為47.29%，醇類物質(zhì)8種，相對含量為26.12%，羧酸類物質(zhì)2種，相對含量為0.25%，烯烴類物質(zhì)2種，相對含量為0.83%，烷烴類物質(zhì)12種，相對含量為5.48%，其他香氣物質(zhì)2種，相對含量為0.22%；未添加氯化銨（CK）發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測得54種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)22種，相對含量為42.55%，醇類物質(zhì)8種，相對含量為31.95%，羧酸類物質(zhì)4種，相對含量為0.77%，烯烴類物質(zhì)4種，相對含量為1.01%，烷烴類物質(zhì)12種，相對含量為5.59%，酮類物質(zhì)2種，相對含量為0.09%，其他香氣物質(zhì)2種，相對含量為0.11%。

表1 蘋果白蘭地香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis of aroma components in apple brandy

續(xù)表

2.3 不同處理發(fā)酵的蘋果白蘭地主體香氣成分對比分析

結(jié)合表1中蘋果白蘭地香氣成分GC-MS分析結(jié)果，對蘋果白蘭地酒中幾種主體香氣成分的作用和相對含量作了進(jìn)一步分析，結(jié)果如表2所示。

表2 蘋果白蘭地中主體香氣成分相對含量Table 2 Relative content of key aroma components in apple brandy

表2結(jié)果表明，不論對照組還是添加氯化銨發(fā)酵的蘋果白蘭地中，酯類是蘋果白蘭地中含量最多的揮發(fā)性化合物，其中相對含量較高的酯類物質(zhì)為乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯；揮發(fā)性酯是組成香氣化合物的最重要種類，大多數(shù)酯類具有花、果香氣，在酵母代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，酯對酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大[8-9]，如辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，是白蘭地酒特有的香味；癸酸乙酯具有葡萄的香氣[10-11]。乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和異丁醇、異戊醇被認(rèn)為是構(gòu)成香氣的基本成分，而其他的揮發(fā)性組分只是補充、改善和修飾上述物質(zhì)所構(gòu)成的基本香氣成分[12]，蘋果白蘭地的香氣基本成分辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯及3-甲基-1-丁醇（異戊醇）在本研究中均被檢出且相對含量較高，這與其他研究結(jié)果有相同之處。醇類是第二大類揮發(fā)性化合物，其中相對含量較高的醇類物質(zhì)為3-甲基-1-丁醇、乙醇；一般醇類物質(zhì)都會給人帶來刺鼻的氣味，在果酒中會給酒香帶來負(fù)效應(yīng)影響，3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香氣，這種香氣能夠持久保持，所以常在食品工業(yè)和化工行業(yè)中用于調(diào)香[13]。綜上所述，揮發(fā)性酯類和醇類物質(zhì)是蘋果白蘭地?fù)]發(fā)性香氣物質(zhì)的主要種類。

從表2還可以看出，雖然對照組與添加組在主體揮發(fā)性物質(zhì)成分組成上具有一致性，但這些成分在相對含量上卻存在一定的差異，添加組中總的酯類物質(zhì)相對含量高于對照組，其含量分別為44.27%和38.61%；從單個酯類物質(zhì)來看，除了己酸乙酯以外，添加組中主要酯類物質(zhì)含量均高于對照組。

對于醇類物質(zhì)而言，添加組的乙醇相對含量和對照組相比增加，而3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對含量降低。異戊醇是高級醇的主要成分，但如含量過高，對人體有害，它的中毒和麻醉作用比乙醇強，能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，令人頭痛，并且在體內(nèi)的氧化速度比乙醇慢，在機體內(nèi)的停留時間長[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，外加氮源對高級醇的生成有很好的抑制作用[15]，本研究結(jié)果顯示，添加外源氮可以提高蘋果白蘭地發(fā)酵酒精度和降低3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對含量，這與有關(guān)報道研究結(jié)果相同，即培養(yǎng)基氮源不足，添加氮源可使高級醇含量降低。

3 結(jié)論

在蘋果白蘭地的揮發(fā)性物質(zhì)中，酯類和醇類占的相對含量較高，構(gòu)成了蘋果白蘭地的主體香氣成分。

蘋果白蘭地發(fā)酵中添加氯化銨有助于提高主要酯類物質(zhì)的相對含量，降低異戊醇的相對含量，其中相對含量較高的香氣物質(zhì)為乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、乙醇。

本研究只是針對無機氮源對蘋果白蘭地香氣成分影響方面做了初步研究。尚需進(jìn)一步研究有機氮源、不同碳源、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)添加對蘋果白蘭地香氣成分的影響。

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