楊 云, 胡筱希, 周凌凌, 高書林, 丁 霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 江蘇 南京 210095）

龍葵多糖對(duì) CCl4致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用研究

楊 云, 胡筱希, 周凌凌, 高書林, 丁 霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 江蘇 南京 210095）

目的 研究龍葵多糖 （ water-soluble polysaccharides from Solanum nigrum L.） 對(duì)四氯化碳 （ CCl4） 致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。 方法 采用 CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型， 連續(xù)給藥 7d 后， 收集小鼠血清及肝組織標(biāo)本， 測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ ALT）、 谷草轉(zhuǎn)氨酶 （ AST） 和堿性磷酸酶 （ALP） 的活性; 檢測(cè)肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、 過氧化氫酶 （CAT） 和谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px） 以及丙二醛 （ MDA） 的水平; 計(jì)算肝臟指數(shù)并同時(shí)對(duì)肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。 結(jié)果 多糖高、 中劑量顯著性抑制 CCl4所致急性肝損傷小鼠血清中 ALT、 AST和 ALP活性的升高 （P＜0.01）， 顯著性降低肝組織中 MDA的水平 （ P＜0.01）， 并顯著性升高 SOD、 GSH-Px和 CAT的活力（P＜0.01）。 肝組織病理切片顯示， 多糖一定程度減輕肝臟組織病理性改變。 結(jié)論 龍葵多糖對(duì) CCl4造成的急性肝損傷小鼠具有顯著的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

龍葵多糖; 保肝; 四氯化碳 （CCl4）; 急性肝損傷

龍葵 Solanum nigrum L.為茄科茄屬草本植物， 一年至 多年生， 幾乎遍布于全國(guó) 各地。 龍葵全草 皆可入 藥， 其性寒，味苦、微甘，亦有小毒，歸肺、腎經(jīng)。具有清熱解毒、利水消腫以及活血化瘀的功效［1］。 臨床上龍葵主要是與其他一些中藥配伍用于治療肝癌［2］、 晚期胃癌［3］、 肺癌［4］等癌癥，療效確切。在中醫(yī)治療慢性乙型肝炎的復(fù)方中，龍葵也是經(jīng)常被用到的一味藥材。龍葵全草含有生物堿、皂苷、多糖、維生素 A類、 維生素 C、酚類化合物等化學(xué)成分［5-6］。

多糖是一種非常重要的信息分子的受體，廣泛存在于生物有機(jī)體內(nèi)，它參與一些關(guān)鍵過程的調(diào)節(jié)，如分子的識(shí)別、細(xì)胞的黏附以及機(jī)體的防御等?，F(xiàn)有的研究成果證實(shí)多糖具有多種多樣的藥理活性，如調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒以及降血糖等［7-8］。 多糖顯示了極為廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，引起了人們?cè)絹碓酱蟮呐d趣，現(xiàn)在多糖已經(jīng)成為了保健品和天然藥物研發(fā)中的重要部分。

文獻(xiàn)報(bào)道龍葵的水提取物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷大鼠和硫代乙酰胺 （ thioacetamide， TAA） 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠均有顯著的保護(hù)作用，然而其保肝活性的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確［9-10］。 多糖是水提取物 中的主要成分 之 一， 通 過前期的實(shí) 驗(yàn) 發(fā) 現(xiàn)， 龍 葵 水 溶 性 多 糖 （ water-soluble polysaccharides from Solanum nigrum L.） 有顯著的保肝活性， 所以本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了龍葵水溶性多糖對(duì) CCl4致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用并對(duì)其保肝機(jī)制進(jìn)行了初步的研究，為龍葵多糖的開發(fā)應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物和試劑 龍葵飲片 （批號(hào) 121114-1） 購(gòu)于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院鑒定為茄科茄屬植物龍葵 （ Solanum nigrum L.） 的全 草。 聯(lián)苯 雙酯滴丸， 北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)， 批號(hào) 12060103; 龍葵多糖， 實(shí)驗(yàn)室自制;四氯化碳購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT） 試劑盒、 谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST） 試劑盒、 堿性磷酸酶 （ALP） 試劑盒、 超氧化物歧化酶 （SOD） 試劑盒、過氧化氫酶 （CAT）、 谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px） 試劑盒、 丙二醛 （MDA） 試劑盒及考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物 雄性 ICR小鼠， 體質(zhì)量 （20 ±2） g， 清潔級(jí)，購(gòu)于南京市江寧區(qū)湯山青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK （蘇） 2008-0009。

1.3 儀器與設(shè)備 電子天平 （美國(guó)雙杰兄弟有限公司）; T-6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）; 低速離心機(jī) （北京雷勃爾有限公司）;KQ-500超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）;RM2235 型石蠟切片機(jī) （德國(guó) Leica公司）;LEICA DM 1000 光學(xué)顯微鏡（德國(guó) Leica公司）。

2 方法

2.1 龍葵多糖的制備 龍葵飲片粉碎成粗粉后， 用 80%乙醇加熱回流提取2次，過濾后得到龍葵殘?jiān)?。取干燥后的龍葵殘?jiān)?加 15 倍量的蒸餾水煎煮 2 次， 每次 4 h。 合并提取液， 減壓濃縮至適量體積， 加入 95%乙醇至最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為 80%， 4 ℃靜止過夜， 離心 （8 000 r/min），收集沉淀物。再將沉淀物溶解在適量的蒸餾水中，利用鹽酸法［11］除去粗多糖中大量的游離蛋白質(zhì)， 大孔樹脂 D-900進(jìn)行脫色后，乙醇沉淀、離心，收集沉淀物，并依次用無水乙醇、丙酮、乙醚抽洗，沉淀真空干燥，即得灰白色龍葵水溶性精制多糖。

2.2 CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的建立 取 60 只雄性 ICR小鼠， 隨機(jī)分成 6 組， 每組 10 只， 分別為正常對(duì)照組，四氯化碳損傷模型組，龍葵多糖的低、中、高劑量組（100、 200、 400 mg/kg） 以及聯(lián)苯雙酯組 （150 mg/kg）。龍葵多糖和聯(lián)苯雙酯均用 0.5%CMCNa溶液混懸， 按 10 mL/kg體積灌胃給藥， 正常組及模型組給予等量的 CMCNa溶液， 每日一次， 連續(xù)7 d。 于末次給藥 2 h后， 除正常組外其余各組小鼠均腹腔注射 0.2%CCl4的橄欖油溶液 10 mL/kg。 禁食不禁水， 16 h 后， 摘眼球取血， 對(duì)小鼠予以脫臼處死，解剖取得肝臟。

2.3 生化指標(biāo)的檢測(cè)與方法

2.3.1 肝臟指數(shù)的計(jì)算 用 4 ℃生理鹽水洗盡肝臟的殘血，除去表面結(jié)締組織，濾紙拭干后稱質(zhì)量，按下式計(jì)算肝臟指數(shù)。

式中:m1為肝臟質(zhì)量 （g）;m2為小鼠體質(zhì)量 （g）。

2.3.2 血清及肝組織中相關(guān)酶活力的檢測(cè) 采集到的血樣在室 溫 放 置 2 h 后 ， 以 3 000 r/min 離 心 10 min 分 離 出 血清， 賴氏法測(cè)定血清中 ALT、 AST和 ALP的活性。 取0.2 g肝臟組織 ， 加冰生 理 鹽 水 1.8 m L， 制 備 10%的 組 織 勻 漿 ，以 3 000 r/min 離 心 10 min 后 取 上清液， 依照試劑 盒 說明書來測(cè)定 SOD、 CAT和 GSH-Px的活性以及 MDA的水平， 利用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定肝勻漿中總蛋白質(zhì)的水平。

2.3.3 肝組織病理學(xué)檢查 取小鼠肝左葉大致相同部位的一小塊肝組織， 用 10%甲醛溶液固定后， 石蠟包埋， 切片（ 片厚 5 μm） ， 蘇木素-伊紅 （HE） 染 色， 然 后 在光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 16.0 軟件 處 理， 以（） 表示， 多 組數(shù)據(jù)間的 比較采用單因素方 差分析，P＜0.05 表示有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 龍葵多糖對(duì)急性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)和肝臟指數(shù)的影響 模型組小鼠血清中 ALT、 AST和 ALP的活性較正常對(duì)照組明顯升高 （ P＜0.01）， 說明本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷３晒Α?龍葵多糖各劑量均能降低肝損傷小鼠血清中 ALT、AST和 ALP的活性， 高、 中劑量組與模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且高劑量組的降酶效果與聯(lián)苯雙酯組相當(dāng)。模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著高于空白組 （P＜0.01）， 說明模型組小鼠肝臟發(fā)生腫脹。龍葵多糖的高、中劑量組能顯著降低由 CCl4升高的肝臟指數(shù)， 說明龍葵多糖對(duì)小鼠肝臟腫脹有一定的緩解作用，見表1。

3.2 龍葵多糖對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織中 SOD、 GSH-Px、CAT的活性以及 MDA的水平的影響 與正常組比較， 模型組小鼠肝組織中 SOD、 GSH-Px和 CAT的活性顯著降低（P＜0.01， 0.001）， MDA水平顯著升高 （P＜0.01）， 說明本次實(shí)驗(yàn)的小鼠急性肝損傷模型造模成功。與模型組比較， 龍葵多糖高、 中劑量均能升高肝組織中 SOD、 GSH-Px和 CAT的活性， 以及降低肝組織中 MDA的水平， 且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 見表2。

表 1 龍葵多糖對(duì)急性肝損傷小鼠血清 AST、 ALT、 ALP和肝臟指數(shù)的影響 （， n=10）

表 1 龍葵多糖對(duì)急性肝損傷小鼠血清 AST、 ALT、 ALP和肝臟指數(shù)的影響 （， n=10）

注: 與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。 下表同

組 別 劑量 /（ mg·kg-1） ALT/（ U·L-1） AST/（ U·L-1） ALP/（ U·L-1） 肝臟指 數(shù) /% 47.96 ±7.65 85.80 ±12.51 51.26 ±7.24 4.84 ±0.63模型組 - 237.94 ±25.55## 250.59 ±27.46## 212.19 ±20.55## 5.84 ±0.85##龍葵多糖低劑量組 100 182.01 ±16.72* 215.96 ±20.29 170.84 ±25.39* 5.33 ±0.75龍葵多糖中劑量組 200 170.80 ±19.45** 178.23 ±22.08** 158.80 ±13.87* 5.21 ±0.45*龍葵多糖高劑量組 400 158.28 ±16.90** 163.88 ±17.73** 135.39 ±16.09** 5.02 ±0.48**聯(lián)苯雙酯組 150 149.98 ±16.61** 159.63 ±15.24** 120.12 ±12.26** 4.99 ±0.52正常對(duì)照組-**

，n=10）表 2 龍葵多糖對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟中 SOD，GSH-Px，CAT和 MDA水平的影響 （

，n=10）表 2 龍葵多糖對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟中 SOD，GSH-Px，CAT和 MDA水平的影響 （

組 別 劑量 /（ mg·kg-1） SOD/（ U·mg-1） GSH-Px/（ U·mg-1） CAT/（ U·mg-1） MDA/（ nmol·mg-1）39.54 ±5.89 85.71 ±8.96 220.79 ±19.93 5.12 ±0.73模型組 - 14.26 ±2.17## 29.70 ±3.87## 133.99 ±18.81## 14.31 ±1.31##龍葵多糖低劑量組 100 17.37 ±3.64 34.95 ±6.30 135.38 ±17.93 11.19 ±1.65**龍葵多糖中劑量組 200 20.54 ±3.32** 39.25 ±3.82** 155.22 ±17.07** 8.48 ±1.14**龍葵多糖高劑量組 400 25.71 ±3.68** 50.27 ±5.13** 172.56 ±18.19** 7.75 ±0.57**聯(lián)苯雙酯組 150 28.02 ±5.30** 58.81 ±6.80** 182.32 ±10.29** 7.06 ±0.75正常對(duì)照組-**

3.3 龍葵多糖對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響 病理切片結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞沒有變性、 壞死等病理性變化 （圖 1-A）。 模型組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞，大部分肝細(xì)胞出現(xiàn)渾濁腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松化，肝細(xì)胞灶性或者片狀壞死以及伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理性改變 （圖 1-B）。 龍葵多糖高、 中劑量組小鼠的肝細(xì)胞壞死，變性以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病變得到了很大程度的減輕 （圖 1-E， 1-F）， 表明龍葵多糖高、 中劑量具有較好的保護(hù)肝細(xì)胞作用， 見圖1。

4 討論

CCl4致肝損傷是經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型。 在CCl4致急性肝損傷動(dòng)物模型中， 主要的肝損傷機(jī)制是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。 CCl4在體內(nèi)一系列酶的作用下， 生成三氯甲基自由基 （ · CCl3） 、 二氯甲基自由基 （ · CCl2） 及 過 氧化甲基自由基 （ ·OOCCl3）。 產(chǎn)生的這些自由基會(huì)攻擊位于肝 細(xì) 胞 膜 上 的 多 不 飽 和 脂 肪 酸 （ polyunsaturated fatty acid）， 從而引發(fā)一系列脂質(zhì)過氧化反應(yīng)， 導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性改變， 肝細(xì)胞內(nèi)的 ALT和 AST等轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)大量釋放到血液中，從而導(dǎo)致血清中這些酶的水平急劇上升。因此，血清中 ALT、 AST和 ALP的水平被廣泛用作于臨床診斷肝臟炎性損傷程度的敏感指標(biāo)［12］。

肝細(xì)胞損傷是很多種肝臟疾病共有的病理基礎(chǔ)，其中氧化應(yīng)激過程在肝細(xì)胞損傷中占有很重要的地位。因而，對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的科學(xué)研究便成為治療肝臟疾病的重要途徑之一［13］。 SOD、 GSH-Px和 CAT是生物機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化酶，它們分工或者合作共同抵御機(jī)體的外源性或內(nèi)生的氧化應(yīng)激損傷。其活力降低之后將會(huì)造成機(jī)體抗氧化能力一定程度的下降，從而使自由基的清除出現(xiàn)障礙，這將導(dǎo)致自由基的堆積，最終一定程度損傷肝細(xì)胞。 MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的終產(chǎn)物， 其水平的高低可以反映出體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。

圖 1 龍葵多糖對(duì) CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟病理改變的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， CCl4肝損傷模型組小鼠的肝組織出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，肝小葉結(jié)構(gòu)有明顯的破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)其中，大部分肝細(xì)胞出現(xiàn)渾濁腫脹等病理性改變，并且血清中 AST、 ALT和 ALP的活性也顯著升高。 龍葵多糖各劑量組小鼠肝細(xì)胞受損程度明顯減少， 血清中 AST、 ALT和 ALP的水平顯著低于 CCl4模型組， 且降酶效果具有劑量依賴性，表明龍葵多糖具有保護(hù)肝細(xì)胞膜，一定程度對(duì)抗肝損傷的作用。

此外， CCl4肝損傷模型組小鼠肝組織中 SOD、 GSH-Px和CAT的活性顯著降低， MDA的水平顯著上升， 說明細(xì)胞清除自由基的能力大幅降低，機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加快，受自由基攻擊的損傷程度增大。而龍葵多糖可顯著提高肝組織中 SOD、 GSH-Px和 CAT的水平， 降低 MDA的水平，表明龍葵多糖能夠提高機(jī)體清除自由基的能力，并且一定程度抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生。

龍葵多糖對(duì) CCl4致急性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。其對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)可能是通過保護(hù)細(xì)胞膜、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來發(fā)揮作用的。

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R285.5

:B

1001-1528（2014）12-2602-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.036

2013-10-12

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金 （KYZ201220）

楊 云 （1987—）， 男， 碩士， 研究方向: 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)。 E-mail:yuny-ok@126.com

*通信作者: 丁 霞 （1963 —） ， 女， 副教授， 碩士生導(dǎo)師， 研究方向: 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)。 E-mail:dingxianjau@126.com

日期:2014-01-26

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