都姣嬌, 杜安妮

（1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 北京 100039； 2.遵義醫(yī)學(xué)院, 貴州 遵義 563003）

固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析石菖蒲中揮發(fā)油成分

都姣嬌1, 杜安妮2

（1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 北京 100039； 2.遵義醫(yī)學(xué)院, 貴州 遵義 563003）

目的 研究固相微萃取法提取石菖蒲中的揮發(fā)油，并鑒定其揮發(fā)油的組成成分。方法 優(yōu)化固相微萃取條件，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)石菖蒲的揮發(fā)油進(jìn)行成分鑒定并確定各成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 結(jié)果 采用固相微萃取法共提取出 33 個(gè)可鑒定成分， 其中含有量較高的主 要成分分別為 α-細(xì)辛 腦 （66.07%）、 2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯（3.63%）、 欖香素 （2.65%）、 畢橙茄烯 （2.90%） 等。 結(jié)論 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法能快速、 全面檢測(cè)石菖蒲揮發(fā)油的主要成分，為其進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

石菖蒲; 揮發(fā)油; 固相微萃取; 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott的干燥根， 其味辛性溫， 具芳香之氣， 行 散之力較強(qiáng)， 為宣氣通 竅之佳 品［1］。 臨床上主要 用于熱 病神昏、癲狂、痰厥、健忘、癡呆、耳聾、耳鳴、心胸?zé)?、跌打損傷等［2］。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)， 揮發(fā)油是石菖蒲鎮(zhèn)靜、催眠、 抗驚厥［3］作用的主要有效部位， 而細(xì)辛醚又是其主要活性成分［4］。 α-細(xì)辛醚具有解痙、 抗驚厥和對(duì)戊巴比妥鈉有協(xié)同等作用; 更有文獻(xiàn)報(bào)道， β-細(xì)辛醚具有平衡大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮和抑制的雙重作用，有利于穩(wěn)定臨床癲癇病人的病情［5-6］。

對(duì)石菖蒲揮發(fā)油成分分析的文獻(xiàn)報(bào)道大都集中在水蒸氣蒸餾提取法和超臨界二氧化碳流體萃取 （SFE-CO2）法［7-8］， 未查詢到關(guān)于用固相微萃取-氣相-質(zhì)譜聯(lián)用研究石菖蒲揮發(fā)油的相關(guān)報(bào)道。 固相微萃取 （SPME） 的最大特點(diǎn)就是集取樣、萃取、富集、進(jìn)樣于一體，因而操作簡(jiǎn)便，并且不需溶劑，萃取速度快、操作成本低、不污染環(huán)境、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化［9-10］。 本實(shí)驗(yàn)采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （SPME-GC-MS） 技術(shù)對(duì)石菖蒲揮發(fā)油成分進(jìn)行分析鑒定，以期對(duì)其今后的相關(guān)研究提供參考。

1 儀器和試劑

手動(dòng)固相微萃取裝置 （ 美國(guó) Supelco公司）;HP-1510氣相色譜頂空加熱器 （上海濟(jì)成分析儀器有限公司）; 萃取纖維頭分別為 100 μm聚二甲基硅氧烷涂層 （PDMS）、 7 μm聚二甲基硅氧烷涂層 （PDMS）、 聚丙烯酸酯 （PA）; 6890-5973N氣 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀 （ 美 國(guó) Agilent公 司 ） ; AL 204 電子天平 （ Mettler Toledo公司） ;JS-05 多功能粉碎機(jī) （浙江武義捷順工具有限公司）。

石菖蒲購(gòu)自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地四川，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院楊建文副主任藥師鑒定為石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott的干燥根。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 固相微萃取提取揮發(fā)油 將石菖蒲置于 45 ℃烘箱中烘至恒定質(zhì)量、 粉碎、 過(guò) 60 目篩。 稱取 0.4 g石菖蒲粉末置于 5mL樣品瓶中， 蓋上瓶蓋， 在 120 ℃下平衡 20 min。萃取頭使用前應(yīng)先進(jìn)行高溫活化。將纖維頭接上手柄后，萃取器插入樣品瓶中，露出石英纖維進(jìn)行萃取，相同溫度下頂空萃取 25 min， 然后將石英纖維退入針頭， 拔出萃取器， 立即將萃取器插入 GC進(jìn)樣口 （溫度 260 ℃）， 露出石英纖維進(jìn)行脫附， 解吸 2 m in， 最后石英纖維退入針頭， 拔出萃取器。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 色譜條件 程序升溫， 初始溫度 50 ℃， 以 5 ℃/ min 的升溫速率升至 125 ℃， 保持 2 min， 然后以 1 ℃ /min的升溫速率升至 140 ℃， 最后以 9 ℃/min 的升溫速率升至230 ℃， 保持 5 min; 汽化室溫度 260 ℃;Agilent HP-5MS色譜柱 （ 30m×0.25 mm×0.25 μm）; 載氣為高純氦氣，體積流量 1.0mL/min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 四極桿溫度150 ℃; 電離方式 EI， 電子能量 70 eV; 離子源溫度 230 ℃; 溶劑延遲 4.0 min; 質(zhì)量掃描范圍 m/z30 ～500。

設(shè)定積分參數(shù)初始峰寬為 0.080， 初始閾值為 16.0，采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，利用美國(guó) Wiley7Nist05、 NIST05 兩種 質(zhì)譜數(shù)據(jù) 庫(kù) 的 質(zhì) 譜數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索比對(duì)， 對(duì)質(zhì)譜圖相似度大于 80%的化合物進(jìn)行收集整理。

3 結(jié)果

3.1 固相微萃取條件的選擇

3.1.1 纖維頭選擇 選擇 100 μm聚二甲基硅氧烷涂層（PDMS） 纖維頭和 7 μm聚二甲基硅氧烷涂層 （PDMS） 纖維頭以及聚丙烯酸酯 （PA） 纖維頭進(jìn)行考察， 按 “2.1”項(xiàng)所述實(shí)驗(yàn)步驟，以檢測(cè)出的總峰面積和峰個(gè)數(shù)作為衡量指標(biāo)， 在相同積分參數(shù)條件下， 100 μm PDMS 共檢出56 個(gè)峰， 總峰面積為 1.008 ×109;7 μm PDMS 共檢出 4 個(gè)峰，總峰面積為 5.237 ×107;PA共檢出 31 個(gè)峰， 總峰面積為5.228 ×108。 結(jié)果證明， 100 μm PDMS 萃取頭所得的峰面積總和及峰個(gè)數(shù)最大，說(shuō)明其能夠更有效地吸附石菖蒲中的揮發(fā)性成分， 因此選用 100 μm PDMS 纖維頭。

3.1.2 樣品用量選擇 分別選用 0.2、 0.4、 0.6、 0.8 g樣品粉末試驗(yàn)，考察色譜峰總面積和峰個(gè)數(shù)，在相同積分參數(shù)條件下， 結(jié)果見(jiàn)圖 1。 結(jié)果表明， 樣品用量變化時(shí)， 各種待測(cè)成分的峰面積變大或變小，而待測(cè)成分種類沒(méi)有很大影響。 樣品用量為 0.4 g時(shí)， 所得峰總面積已經(jīng)達(dá)到最大，且峰分離度好、不拖尾。

圖1 樣品用量對(duì)總峰面積的影響

3.1.3 平衡時(shí)間選擇 保持其他條件不變， 改變樣品平衡時(shí)間從 15 min 延 長(zhǎng) 至 35 min， 考 察 平衡 時(shí) 間 與總 峰 面積的關(guān)系。設(shè)定相同的積分參數(shù)條件，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)平衡時(shí)間為 20 m in 時(shí)， 總峰面積達(dá)到最大， 之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)， 總峰面積有所減少， 說(shuō)明 20 min 樣品已達(dá)到考察條件內(nèi)的最大值。 因此選擇 20 min 為樣品最適宜平衡時(shí)間。

圖2 平衡時(shí)間對(duì)總峰面積的影響

3.1.4 萃取溫度選擇 分別選擇 60 ～130 ℃ （每 10 ℃為一個(gè)溫度梯度）作為參照，以色譜峰總面積和峰個(gè)數(shù)作為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖 3。結(jié)果表明，隨著萃取溫度的上升， 總峰面積也隨之增加， 當(dāng)?shù)竭_(dá) 120 ～130 ℃時(shí)， 總峰面積達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。并且考慮到萃取溫度太高，萃取頭的吸附量較大， 記憶效應(yīng)也較大， 故選擇 120 ℃為最適宜萃取溫度。

3.1.5 萃取時(shí)間選擇 實(shí)驗(yàn)選定 10、 15、 20、 25、 30、35 min 萃取時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)分析， 以色譜峰總面積和峰個(gè)數(shù)作為考察指標(biāo)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)曲線圖 4。 隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)， 總峰面積也隨之增加， 當(dāng)萃取時(shí)間為 25 min 時(shí)達(dá)到最大值，之后總峰面積基本不變，說(shuō)明此時(shí)分析組分的吸附與解析已達(dá)到平衡。 因此， 選擇 25 min 作為最佳萃取時(shí)間。

圖3 萃取溫度對(duì)總峰面積的影響

圖4 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響

3.1.6 解吸時(shí)間選擇 萃取頭吸附樣品之后插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，若解吸時(shí)間過(guò)短，可能導(dǎo)致解吸不完全，會(huì)產(chǎn)生記憶效應(yīng)，影響下一次測(cè)定;若解吸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)使進(jìn)樣時(shí)間變長(zhǎng)，色譜峰則會(huì)變寬。合適的解吸時(shí)間能夠保證萃取纖維上被富集吸附的待測(cè)成分更完全地解吸，防止在纖維涂層上殘留。 選定 1、 2、 3 min 進(jìn)行解吸分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 2 m in 即可解吸完全。

3.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 按 “2.1” 項(xiàng)下操作條件下， 進(jìn)行萃取進(jìn)樣分析，重復(fù)6次，在相同積分參數(shù)條件下，以石菖蒲揮發(fā)油成分的總峰面積值為考察指標(biāo)， 計(jì)算其 RSD，結(jié)果為 2.1%， 表明該方法重復(fù)性良好， 最佳萃取條件下的萃取量精確，適于石菖蒲揮發(fā)油成分的分析鑒定。

3.3 固相微萃取成分分析結(jié)果 最優(yōu)條件下固相微萃取得到的揮發(fā)油經(jīng) GC-MS 分析結(jié)果得到 34 個(gè)成分， 其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為 86.99% （相似度 80%以上）， 總離子流圖見(jiàn)圖5， 成分分析結(jié)果見(jiàn)表 1。

圖5 固相微萃取石菖蒲揮發(fā)油總離子流圖

4 結(jié)論

固相微萃取法收集的成分能比較真實(shí)地反映中藥中的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，固相微萃取技術(shù)是集取樣、萃取、富集、進(jìn)樣于一身， 大大縮短了操作時(shí)間 （一般只需 0.5 ～1 h），一定程度上提高了分析靈敏度。石菖蒲揮發(fā)油經(jīng)固相微萃取， GC-MS 分析， 共有 33 種成分得到有效分離， 相對(duì)質(zhì)量

分?jǐn)?shù)和為 86.99%。 揮發(fā)油成分主要為結(jié)構(gòu)通式為 C15H24和C12H16O3的化合物及其衍生物， 其中相對(duì)質(zhì)量 分?jǐn)?shù)較 高的有 α-細(xì)辛腦 （66.07%）， 細(xì)辛醚、 β-細(xì)辛醚均有鎮(zhèn)靜作用和抗驚厥作用， 2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯 （3.63%）、 欖香素 （2.65%）、 畢橙茄烯 （2.90%） 等。 采用 SPME萃取石菖蒲揮發(fā)油， 最佳的萃取條件為 100 μm PDMS 纖維萃取頭萃取， 在 120 ℃下平衡 20min， 吸附 25min， 260 ℃下解吸附 2 min。 SPME-GC-MS 技術(shù)能全面、 快速地獲得其組成信息，重復(fù)性好，且操作時(shí)間短，樣品量小，無(wú)需萃取溶劑，可用于石菖蒲揮發(fā)油的快速檢測(cè)、分析。

表1 固相微萃取分析結(jié)果

［ 1 ］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010:62.

［2］ 韓亞亮， 劉 萍，何新榮， 等.石菖蒲揮發(fā)油的基本成分及其藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)， 2011，2（8）:120-123.

［ 3 ］ 苗靜琨， 吳小玫， 陳啟雄， 等.石菖蒲 α-細(xì)辛醚抗癲癇作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2008， 24（12）:1660-1662.

［ 4 ］ 劉春海， 劉西京， 楊華生.石菖蒲揮發(fā)油的 GC-MS 分析［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊， 2006， 24（7）:1280-1281.

［ 5 ］ 柯雪紅， 方永奇.RP-HPLC測(cè)定石菖蒲、 水菖蒲藥材中 β-細(xì)辛醚、 α-細(xì)辛醚的含量［J］.中國(guó)中藥雜志， 2004， 29（3）:279-280.

［ 6 ］ 劉曉鴻， 張明生.β-細(xì)辛醚的藥代及藥理作用研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐， 2009， 22（5）:542-544.

［7］ 周明哲， 王嗣岑，陳 湘， 等.石菖蒲水蒸氣蒸餾提取物和超臨界提取物的 GC-MS 分析［J］.藥物分析雜志，2010， 30（2）:185-189.

［ 8 ］ 鐘 麗， 傅 芬.SPME-GC-MS 聯(lián)用分析紫蘇揮發(fā)性成分［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2010， 21（7）:1735-1738.

［9］ 陳偉光， 趙玉妍.固相微萃取技術(shù)在化學(xué)分析中的應(yīng)用［J］.職業(yè)與健康， 2006， 22（9）:646-648.

［10］ 胡國(guó)棟.固相微萃取技術(shù)的進(jìn)展及其在食品分析中應(yīng)用的現(xiàn)狀［J］.色譜， 2009， 27（1）:1-8.

R284.1

:B

1001-1528（2014）12-2645-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.049

2013-09-02

都姣嬌 （1975—）， 女， 主管中藥師， 研究方向: 天然產(chǎn)物化學(xué)。 Tel:13717943795， E-mail:dujiaojiao1975@163.com