蘭艷素, 李長江, 宋坤鵬, 管超建

（黃山學院化學化工學院, 安徽 黃山 245041）

星點設計-效應面法優(yōu)化百蕊草總黃酮提取工藝

蘭艷素, 李長江, 宋坤鵬, 管超建

（黃山學院化學化工學院, 安徽 黃山 245041）

目的 利用響應面分析法對百蕊草總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。方法 在單因素試驗基礎上，確定乙醇體積分數(shù)、 液料比、 提取時間為 3 個自變量， 總黃酮得率為因變量， 通過星點設計-響應面法優(yōu)化總黃酮提取工藝條件， 并進行預測分析。 結(jié)果 液料比和提取時間對百蕊草總黃酮的提取影響極顯著， 最優(yōu)提取工藝為 乙醇體積分數(shù) 70%，提取時間 40min， 液料比 20 ∶1 （ mL/g）。 在此條件下， 黃酮提取量達到 13.58mg/g。 結(jié)論 該方法合理、 簡便、 快速，可預測性較優(yōu)。

百蕊草;總黃酮;星點設計;響應面法

百蕊草為檀香科植物百蕊草 Thesium chinensis Turcz.的全草［1］， 又叫百乳草、 細須草、 地石榴等［2］， 多生于沙地草叢中或石坎邊，我國南北各省區(qū)等地均有分布，而且產(chǎn)量較高［3］。 百蕊草最早載于 《 圖經(jīng)本草》， 味微澀苦， 性溫， 常被稱為 “ 植物抗生素”［4-5］， 是 我 國 民 間 常 用 中 藥。具有很好的抗菌、消炎、解熱、鎮(zhèn)痛以及補氣益腎等作用［6-7］， 臨床上 經(jīng) 常 用 于 治 療 急 性 乳 腺 炎、 腎虛腰痛、 肺炎、乳癰、遺精、肺膿瘍、黃疸、扁桃體炎以及各種上呼吸道感染等病癥［8-10］。

百蕊草中含有的化學成分有黃酮、多糖、苷類、生物堿及礦質(zhì)元素等， 其中黃酮類化合物的量最為豐富［11］。 到目前為止， 已經(jīng)從百蕊草中分離得到 10 個黃酮類化合物［3，12］， 且所含的黃酮類化合 物 具有較好 的 抗 菌、 消炎活性［13］。 因此， 對百蕊草中總黃酮的研究具有重大意義。

本實驗采用超聲波輔助提取百蕊草總黃酮，在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間為自變量，總黃酮得率為因變量，采用星點試驗設計，通過效應面法進行數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化百蕊草總黃酮的提取工藝，以期為百蕊草的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 百蕊草產(chǎn)于安徽， 購于亳州萬生中藥飲片有限公司， 批號 100601， 經(jīng)生命與環(huán)境工程學院方建新老師鑒定為檀香科植物百蕊草的全草。 蘆丁對照品 （批號 10080-200707， 購于中國藥品生物制品檢定所）; 乙醇購自黃山酒精廠;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純;重蒸餾水自制。

1.2 儀器 UV-2100 型紫外可見分光光度計 （北京北分瑞利分析儀器有限公司）;KH-500B超聲波清洗器 （昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;TG165 高速離心機 （長沙平凡儀器儀表有限公司）; 電子分析天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;GZX-9030 MBE電熱鼓風干燥箱 （上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;FW100 型高速萬能粉碎機 （天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方法

2.1 供試液的制備

2.1.1 蘆丁對照品溶液的制備 將蘆丁對照品置于真空干燥箱中， 在 105 ℃條件下干燥至恒定質(zhì)量， 精密稱取 12.5 mg干燥后的蘆丁對照品于干凈燒杯中， 用 60%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至 50 mL量瓶中， 60%乙醇定容至刻度線， 搖勻即得蘆丁對照品溶液， 該溶液質(zhì)量濃度為 0.25 mg/m L， 備用。

2.1.2 百蕊草總黃酮的提取 稱取干燥后的百蕊草粉末樣品 1.0 g， 在 100 mL圓底燒瓶中， 分別在一定的乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比條件下，采用超聲法輔助提取百蕊草總黃酮， 提取液冷卻， 離心機低速離心 10 m in 后， 移取上層清液5mL置于50mL量瓶中， 乙醇定容刻度線， 作為待測溶液。

2.2 總黃酮定量測定

2.2.1 標準曲線的制作 分別精密移取 0.25 mg/mL蘆丁對照品溶液 0.0、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0 mL， 置于 25 mL量瓶中， 分別加 60%乙醇至 6 mL， 加入 5%亞硝酸鈉溶液 1.0 mL， 搖勻， 放置 6 min， 然后加入 10%硝酸鋁溶液 1.0mL， 搖勻后放置 6min， 再加 4%的氫氧化鈉溶液 10 m L， 最后用 60%乙醇溶液定容至刻度線， 搖勻， 放置 15 m in， 以空白液作參照， 在 510 nm波長處測定吸光度值［14］。 制作蘆丁標 準 工作曲線， 得 線性回歸 方 程:y= 10.107x+0.045 9， r2=0.999 7， 線性關系良好。

2.2.2 樣品中總黃酮量的測定 用移液管移取 5.0 mL待測液于25 mL量瓶中， 按 “2.2.1” 項下的操作方法， 分別加入亞硝酸鈉、 硝酸鋁和氫氧化鈉， 靜置 15 min 后在 510 nm處測定提取液的吸光度 A值， 由標準曲線方程計算得出樣品溶液的質(zhì)量濃度，再計算出樣品中總黃酮的量。計算公式為: 樣品中總黃酮量 （以蘆丁計）

式中:Y為黃酮提取量 （mg/g）;A為吸光度;V為離心之后的上清液體積 （mL）;m為樣品質(zhì)量 （g）。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密移取 0.25 mg/mL蘆丁對照品溶液 1.0mL于 25mL量瓶中， 按照 “2.2.1” 項下方法測定溶液在510 nm處的吸光度值。 結(jié)果 RSD為1.2% （n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取制備好的百蕊草提取液 1.0 mL，置于25 mL量瓶中， 按 “2.2.1” 項下方法操作， 顯色后每隔 15 min 測定溶液在 510 nm處的吸光度值。 實驗結(jié)果顯示， RSD為 1.1% （n=6）， 表明供試品溶液在 1.5 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 移取制備好的百蕊草提取液 6 份， 每份 1 mL， 按照 “2.2.1” 項下方法測定溶液在 510 nm處的吸光度值， 結(jié)果 RSD為 1.0%， 表明方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密量取已知總黃酮量的百蕊草提取液 6 份， 再分別加入 0.25 mg/mL蘆丁對照品溶液 1.0 mL， 按照 “2.2.1” 項下方法測定溶液在 510 nm處的吸光度值， 計算回收率， 平均回收率為 99.9%， RSD為 1.1%。

2.4 單因素試驗

2.4.1 稱取百蕊草粗粉 6 份， 每份1.0 g， 分別加入20mL體積分數(shù)分別為 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和 90%的乙醇溶液， 在溫度為 60 ℃條件下提取 30 min， 提取液按“2.2.1” 項下的操作方法顯色后測定溶液吸光度值， 并計算總黃酮量。

2.4.2 稱取百蕊草粗粉 5 份， 每份 1.0 g， 分別加入 70%乙醇溶液 20 mL， 溫度為 60 ℃條件下分別提取 20、 30、40、 50 和 60 min， 提取液按 “2.2.1” 項下的操作方法顯色后測定溶液吸光度值，并計算總黃酮量。

2.4.3 稱取百蕊草粗粉 5 份， 每份 1.0 g， 分別加入 10、15、 20、 25、 30、 35mL 70%乙醇溶液， 溫度為 60 ℃條件下提取 40 min， 提取液按 “2.2.1” 項下的操作方法顯色后測定吸光度值，并計算總黃酮量。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 乙醇體積分數(shù)對百蕊草總黃酮提取率的影響 由圖1可以看出，乙醇體積分數(shù)較低時，總黃酮的提取率很小，隨著乙醇體積分數(shù)的升高，總黃酮的提取率逐步增加，當乙醇體積分數(shù)為 70%時， 總黃酮的提取率達到最大值， 乙醇體積分數(shù)高于 70%時， 黃酮的量開始下降。 因此， 確定乙醇體積分數(shù)為 70%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響

3.1.2 提取時間對百蕊草總黃酮提取率的影響 由圖 2 可知，提取時間很短時，黃酮得率較低，隨著提取時間的延長， 總黃酮提取量逐漸增加， 當提取時間為 40 min 時達到最大值。 40 min 后， 百蕊草總黃酮量趨于穩(wěn)定， 故提取時間選取 40 min。

圖2 提取時間對黃酮提取率的影響

3.1.3 液料比對百蕊草總黃酮提取率的影響 由圖 3 可見， 當液料比為10∶1 時， 黃酮得量很低， 之后快速增加，在 15 ∶1 到 30 ∶1 之間變化時， 黃酮提取率的變化不大，當液料比為20 ∶1 時提取率達到最大值， 原因可能是溶劑量越多，藥材和溶劑的接觸越充分，提取量呈上升趨勢，但是當溶劑達到一定量之后，再增加溶劑的量，對提高黃酮得率也沒有太大幫助，由于加大溶劑的量，會提高提取的成本， 因此， 液料比選 20 ∶1。

圖3 液料比對黃酮提取率的影響

3.2 星點設計試驗

3.2.1 實驗設計與結(jié)果 在單因素試驗所得數(shù)據(jù)的基礎上，根據(jù)星點實驗設計原理，以百蕊草總黃酮得率為響應值，乙醇體積分數(shù)、液料比和提取時間為考察因素，分別用 X1、 X2、 X3表示， 每個因素設五水平， 并以 1.73、 1、0、 -1、 -1.73 表示自變量的高低水平， 各因素水平編碼見表 1。 星點實驗設計及結(jié)果見表 2。

表1 因素水平

表2 實驗設計與結(jié)果

3.2.2 模型擬合 以總黃酮提取率為響應值， 采用 Design Expert軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析， 得到乙醇體積分數(shù)、提取時間和液料比對總黃酮提取率影響的二項式方程，擬合后，得到回歸模型方程為:

對該模型進行回歸方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

由表 3 可知， 該模型 P＜0.000 1， 表明實驗所得的回歸模型方程極顯著。在本實驗設定的區(qū)域范圍內(nèi)，液料比和提取時間的 P值均小于 0.000 1， 對總黃酮得率的影響極顯著， 乙醇體積分數(shù) P值小于 0.01， 影響顯著， 總的來說，各因素對響應值的影響順序為:液料比＞提取時間＞乙醇體積分數(shù)。

表3 響應面分析試驗方差分析結(jié)果

交互項中乙醇體積分數(shù)與提取時間的交互作用對總黃酮得率的影響極顯著，乙醇體積分數(shù)與液料比次之，液料比和提取時間的交互作用對總黃酮得率不明顯，即在提取過程中，總黃酮得率可以忍受液料比和提取時間的微小變化，而不至于產(chǎn)生較大的影響。二次項中均小于 0.000 1， 對響應值的影響都極顯著， 所以乙醇體積分數(shù)、液料比和提取時間對總黃酮提取率的影響并非簡單線性關系，而應該是二次曲線關系。

方程的失擬項 P值為 0.337 3， 失擬項不顯著， 說明其他未知因素對試驗結(jié)果的影響較小，擬合檢驗極顯著。所以，該方程與實際情況擬合很好，能夠較好地反映百蕊草總黃酮提取率與乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間的關系，可對百蕊草總黃酮的提取工藝參數(shù)進行較好預測。

3.2.3 效應面優(yōu)化和預測 根據(jù)回歸方程， 利用 Design-Expert軟件， 繪制得到交互作用影響比較顯著的三維效應曲面， 見圖 4、 圖 5。

圖4 提取時間與乙醇體積分數(shù)交互影響黃酮得率的響應面圖

由圖4可見，當液料比一定，乙醇體積分數(shù)與提取時間的交互作用影響顯著，隨著提取時間延長和乙醇體積分數(shù)的增大，總黃酮提取率都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而且乙醇體積分數(shù)在 60% ～80%之間變化時， 總黃酮得率的變化范圍較大，即乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響比液料比大。

圖5 液料比與乙醇體積分數(shù)交互影響黃酮得率的響應面圖

由圖5可見，液料比與乙醇體積分數(shù)的交互作用影響曲面開口往下，曲面較陡峭，影響顯著。總黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)、液料比的增大而增加，并分別在液料比為20 ∶1 （m L/g）、 乙醇體積分數(shù)為 70%附近出現(xiàn)最高點， 之后開始降低，且乙醇體積分數(shù)降低的程度更大一點，說明乙醇體積分數(shù)對響應值的影響比液料比強。

總體來看，乙醇體積分數(shù)是3個因素當中對總黃酮提取率的影響最顯著。對回歸模型進行分析，黃酮提取率最大預測值為 13.58mg/g， 最優(yōu)提取工藝條件為: 乙醇體積分數(shù) 70.19%， 提 取 時 間 42.10 min， 液 料 比 18.83 ∶1（mL/g）。

3.3 驗證試驗 為了檢驗該模型的準確度， 對模型優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝結(jié)果做驗證性試驗，從具體操作條件來考慮，將工藝條件修正為乙醇體積分數(shù) 70%， 提取時間 40 min，液料比 20 ∶1 （mL/g）， 在該條件下， 做 5 次平行試驗。 驗證試驗測得總黃酮的平均得率為 13.76 mg/g， 相對誤差1.6%， 與預測值基本一致， 說明該模型與實際試驗點擬合較好，模型方程可靠、實用。因此，基于星點設計所得的最佳工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

4 討論

正交設計法、均勻設計法經(jīng)常被應用于中藥有效成分的提取工藝研究，雖然以上兩種方法的試驗次數(shù)少，但在設定的實驗區(qū)域內(nèi)，很難找到一個明確的函數(shù)式來表達各因素和響應值之間的關系，所以也就無法找到整個區(qū)域上考察因素的最佳組合，并對響應值的最優(yōu)值進行預測。星點設計-響應面優(yōu)化法可以彌補以上不足， 采用非線性數(shù)學模型擬合，并在中心點進行重復性試驗，可以提高實驗精確度。 所以實驗采用星點設計-響應面優(yōu)化法對百蕊草總黃酮提取工藝進行了研究，該法簡便、穩(wěn)定。

本實驗在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比為自變量，總黃酮得率為因變量，采用星點試驗設計，效應面法進行分析，得到超聲波法輔助提取百蕊草總黃酮的最佳工藝條件為 70%乙醇提取， 提取時間40 min， 液料比 20 ∶1 （ m L/g）， 此條件下總 黃酮得 率為13.58 mg/g。

［1］ 羅夫來，郭巧生.百蕊草礦質(zhì)元素含量測定和主成分分析［ J］ .中國中藥雜志， 2010， 35 （10）:1226-1230.

［ 2 ］ 路 鋒， 趙穩(wěn)操， 賈艷星， 等.百蕊草屬藥學研究概況［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學， 2011， 39（31）:19091-19092.

［ 3 ］ 魯云霞， 汪俊松.百蕊草的化學成分研究［J］.中草藥，2004， 35（5）:491-492.

［4］ 儲曉琴，胡葉青，岳 磊.大孔吸附樹脂純化百蕊草總黃酮工藝研究［J］.中藥材， 2013， 36（3）:478-481.

［5］ 羅夫來， 郭巧生，王長林， 等.寄主對半寄生植物百蕊草影響的綜合評價研究［ J］.中國中藥雜志， 2012， 37（9）: 1174-1179.

［6］ 鐘方麗，王曉林，紀萍萍，等.百蕊草中總黃酮的提取工藝研究［ J］ .吉林化工學院學報， 2008， 25（4） :5-7.

［ 7 ］ Parveen Z， Deng Y L， Saeed M K， etal.Antiinflammatory and analgesic activities of Thesium chinense Turcz extracts and its major flavonoids， kaempferol and kaempferol-3-O-glucoside［ J］ .Yakugaku Zasshi， 2007， 127（8）:1275-1279.

［ 8 ］ 唐慧文， 宋曉寧， 駱紅梅.HPLC法測定百蕊草中山奈酚的含量［J］.貴陽中醫(yī)學院學報， 2006， 28（4）:60-61.

［9］ 徐國兵，黃萬著，王德群，等.百蕊草藥材中山奈酚和總黃酮的含量測定［ J］.中醫(yī)藥學報， 2008， 36（1） :39-41.

［10］ 儲曉琴， 岳 磊， 胡葉青， 等.正交設計優(yōu)選百蕊草的提取工藝［J］.安徽中醫(yī)學院學報， 2013， 32（2）:80-82.

［11］ 王 崢， 李紹順.百蕊草藥材及其制劑中總黃酮的含量測定研究［J］.中成藥， 2007， 29（1）:138-139.

［12］ 劉 洋， Zahida P， 鄧玉林， 等.百蕊草中黃酮類化合物研究［J］.中草藥， 2009， 32（4）:518-520.

［13］ 劉永松， 潘 玲， 祁克宗， 等.百蕊草有效提取成分對七種細菌的敏感性試驗［J］.貴州醫(yī)藥， 2006， 30（6）:564-566.

［14］ 田寶成， 賈昌平， 楊軍濤， 等.Box-Behnken 效應面法優(yōu)化紅旱蓮總黃酮提取工藝的研究［J］.中成藥， 2010， 32（3）: 389-392.

R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2629-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.044

2013-10-23

安徽高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目 （2013SQRL088ZD）; 安徽省高校省級自然科學研究項目 （KJ2011B168）; 黃山學院自然科學基金項目 （2011xkj017）

蘭艷素 （1985—）， 女， 碩士， 助教， 從事天然產(chǎn)物提取分離與活性研究。 Tel:13685595775， E-mail:ls7536858@163.com