謝 松, 宋良科, 萬 軍, 童志平, 譚 睿, 劉小珍

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 成都 610031）

HPLC法測定草原老鸛草中莽草酸和沒食子酸

謝 松, 宋良科, 萬 軍, 童志平*, 譚 睿, 劉小珍

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 成都 610031）

目的 利用 HPLC法對草原老鸛草中莽草酸和沒食子酸進行定量測定， 建立草原老鸛草定量分析的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 方法 Agilent TC-C18色譜柱 （4.6 mm ×250 mm， 5 μm） ， 以乙腈 -1%磷酸溶液 （5 ∶95 ） 為流動相， 體積流量為 0.6mL/min， 檢測波長為 211 nm， 柱溫 25 ℃。 結(jié)果 莽草酸、 沒食子酸的線性范圍分別為 0.196 ～1.372 μg（r= 0.999 5）、 0.270 ～1.890 μg（r=0.999 9）， 平均回收率為 99.7% （RSD 1.7%）、 101.5% （RSD 1.6%）。 結(jié)論 9批藥材中莽草酸平均質(zhì)量分數(shù)為 1.937 9mg/g， 沒食子酸平均質(zhì)量分數(shù)為 2.438 7 mg/g， 可作為草原老鸛草藥材的質(zhì)量控制方法。

草原老鸛草;莽草酸;沒食子酸;質(zhì)量控制;高效液相色譜

草原老鸛草 Ceranium pratens e L.為牻牛兒苗科老 鸛 草 屬 植 物 的 干 燥 全 草［1］， 藏 藥 譯 名 為 拉崗［2］。 異名喀圖曼巴［3］、 辛木頭勒曼巴［4］等， 拉崗始出 《晶珠本草》， 分布于四川西北部， 西藏東北部和青海東南部的高山草甸和灌木草叢。味苦、甘、性寒，具有清熱止痛、利肺殺蟲的功效，用于止瀉消炎，解毒排膿，消化不良，為常用的藏藥材之一?，F(xiàn)報道草原老鸛草含鞣質(zhì)、沒食子酸、兒茶素［5］、 莽草酸［6］等多酚類化合物， 現(xiàn)代藥理實驗表明莽草酸和沒食子酸具有消炎、止瀉及解毒等作用［7-10］， 與草 原 老 鸛 草 的 功 效 相 關(guān)。因 此， 采 用HPLC法同步測定草原老鸛草中莽草酸和沒食子酸的量，為藏藥草原老鸛草的藥理藥效學(xué)研究和進一步開發(fā)利用奠定良好的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC-10A高效液相色譜儀， LC-10A雙泵， SIL-10A自動進樣器， SPD-M10A檢測器， CTO-10A柱溫箱，CLASS-VP色譜工作站， 電子分析天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥 沒食子酸對照品 （中國生物制品藥品檢定 所， 批 號 110831-200803 ）; 莽 草 酸 對 照 品（成都瑞芬思科技有限公司， 批號 M-003-130511）; 9 批草原老鸛草藥材于 2013 年 7 月采自四川省阿壩州馬爾康縣、紅原縣和若爾蓋縣不同生境，經(jīng)宋良科鑒定為草原老鸛草 Ceranium pratense L.。 所用樣品粉末均已過三號篩。乙腈為色譜純，甲醇、乙醇和磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 （4.6 mm × 250 mm，5 μm）， 流 動 相 為 乙 腈-1% 磷 酸 溶 液（5 ∶95 ），檢 測 波 長 211 nm， 體 積 流 量 0.6 mL/min， 柱溫 25 ℃， 進樣量 10 μL。 在上述色譜條件下按莽草酸峰計算理論板數(shù)不低于 3 000， 各被測組分與相鄰峰之間分離度大于 1.5，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 （A） 和樣品 （B） 的 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances（A）and sam p les（B）

2.2 對照品溶液的制備 分別取莽草酸和沒食子酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成含莽草酸 98.0 μg/mL、 沒食子酸135.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末 （過三號篩） 約 0.5 g， 精密稱定， 置圓底燒瓶中， 加入50%甲醇 50 mL， 稱定質(zhì)量， 加熱回流 4 h， 放冷，再稱定質(zhì)量， 用50%甲醇補足減失的質(zhì)量， 搖勻，用有機微孔濾膜 （0.45 μm） 濾過， 取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液 2、 4、 6、 8、 10、 14 μL注入液相色譜儀， 測定峰面積， 以峰面積為縱坐標(biāo)， 進樣量 （μg） 為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得莽草酸回歸方程為 Y= 3.986 8 ×107X+394 592， r=0.999 5， 沒食子酸回歸方程為 Y=1.376 9 ×107X+6 395，r= 0.999 9。 結(jié)果表明莽草酸和沒 食 子酸分別在0.196 ～1.372 μg、 0.270 ～1.890 μg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密稱取 5 號樣品粉末 0.5 g，制備供試品溶液， 進樣 10 μL， 連續(xù)進樣 6 次， 測定峰面積，并分別計算莽草酸和沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)， 測得莽草酸和沒食子酸質(zhì)量分數(shù)的 RSD均為0.2%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取 5 號樣品粉末 0.5 g，制備供試品溶液， 于室溫下保存， 分別于 0、 2、4、 8、 12、 24 h 進樣， 測定峰面積， 并分別計算莽草酸和沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)，測得莽草酸和沒食子酸質(zhì)量分數(shù)的 RSD分別為 0.3%、 0.8%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取 5 號樣品粉末 6 份，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，并分別測定莽草酸和沒食子酸量，測得樣品中莽草酸和沒食子酸的質(zhì)量分數(shù) RSD分別為 0.7%、 1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱取已測定含有量的 5 號樣品粉末0.25 g（共 6 份）， 分別精密加入莽草酸和沒食子酸對照品溶液各 10 mL（質(zhì)量濃度分別為0.048 mg/m L、 0.067 mg/mL）， 分別制備供試品溶液，測定并計算回收率，莽草酸和沒食子酸的平均回 收 率 分 別 為 99.7%、101.5%，RSD 分 別 為1.7%、 1.6%。 結(jié)果見表 1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 樣品測定 取各批次樣品粉末0.5 g（過三號篩）， 精密稱定， 按 “2.3” 項方法制備供試品溶液，分別測定并計算莽草酸和沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表2。

表 2 草原老鸛草中莽草酸和沒食子酸的測定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Determ ination of shikim ic acid and gallic acid in Geranium pratense L.（n=3）

3 討論

3.1 精密稱取同一批樣品分別考察 （超聲， 回流，冷浸） 提取方法， 提取溶劑 （水， 乙醇，50%甲醇， 70%甲醇， 甲醇） 和提取時間進行考察， 結(jié)果表明 50%甲醇加熱回流提取 4 h， 為草原老鸛草藥材的最佳提取條件。

3.2 莽草酸和沒食子酸均屬于酚酸類化合物， 均具有較強的紫外吸收， 參考文獻 ［11-12］ 選用乙腈與不同質(zhì)量濃度磷酸溶液為流動相?？疾煲砸译?0.1%磷酸溶液為流動相，檢測波長為 270 nm，沒食子酸目標(biāo)峰能被分離檢測，而莽草酸目標(biāo)峰未被檢出。 用乙腈-1%磷酸溶液為流動相， 檢測波長為211 nm，結(jié)果莽草酸和沒食子酸均能在較短時間被分離檢測; 考察柱溫 （25、 30、 35 ℃）、體積流量 （0.6、 0.8、 1.0 mL/min） 對目標(biāo)成分的分離效果， 結(jié)果柱溫 25 ℃、 體積流量為 0.6 mL/min峰型對稱性好，理論板數(shù)高，分離效果較佳，該條件可同時測定莽草酸和沒食子酸。

3.3 經(jīng)測定， 9 批草原老鸛草藥材中莽草酸的含有量為 1.595 9 ～2.269 9 mg/g， 平均值 1.937 9 mg/g， 沒食子酸含有量為 1.702 6 ～3.164 6 mg/g，平均值 2.438 7 mg/g。 實驗證明該方法簡便、 準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為草原老鸛草藥材的質(zhì)量控制方法。但各批次目標(biāo)成分含有量差異可能與采收期、產(chǎn)地環(huán)境等因素有關(guān)，值得進一步探討。

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Determ ination of shikim ic acid and gallic acid in Geranium pratense L.by HPLC

XIE Song， SONG Liang-ke， WAN Jun， TONG Zhi-ping*， TAN Rui， LIU Xiao-zhen

（ School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China）

AIM To establish an HPLCmethod for the determination of shikimic acid and gallic acid in Ceranium pratense L.METHODS The analytical column was Agilent TC-C18column （4.6 mm ×250 mm， 5 μm）with acetonitrile-1%aqueous acetic acid （5 ∶95） asmobile phase.The flow rate of0.6 mL/min， the UV detection was set at211 nm and the column temperature was at 25 ℃.RESULTS The linear ranges were 0.196 ～1.372 μg for shikimic acid （ r=0.999 5） and 0.270 ～1.890 μg for gallic acid （r=0.999 9） ， respectively. The average recoveries of shikimic acid and gallic acid were 99.7% （ RSD 1.7%） and 101.5% （ RSD 1.6%） ，respectively.CONCLUSION The nine batches of herbs that the average content of shikimic acid is 1.937 9 mg/g and the average content of gallic acid is 2.438 7 mg/g.Themethod could be used for quality control for this herb.

Ceranium pratense L.;shikimic acid;gallic acid;quality control;HPLC

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2534-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.024

2013-12-23

四川省藏藥標(biāo)準(zhǔn)制定工作子項目 （024131113010040）

謝 松 （1983—）， 男 （ 白族） ， 碩士 生， 主 要從事藥物 化學(xué)與質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)研究。 Tel:1520867270， E-mail:xiesong.2007@ 163.com

*通信作者: 童志平， 男， 副教授， 主要從事藥物化學(xué)研究。 E-mail:tzp-008@163.com