張 慧, 海廣范, 栗志勇, 張 婷, 呂潔麗

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.安陽市三醫(yī)院胸外科 河南 安陽 453000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003）

[制 劑]

白芷中抗內(nèi)毒素血癥有效組分的譜效關(guān)系

張 慧1, 海廣范1, 栗志勇2, 張 婷3, 呂潔麗4*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.安陽市三醫(yī)院胸外科 河南 安陽 453000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003）

目的 研究白芷抗內(nèi)毒素血癥的有效活性成分。方法 采用腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn)和小鼠注射脂多糖+D-氨基半乳糖溶液所致內(nèi)毒素血癥模型， 考察白芷的石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇、 水提部位的抗炎、 抗內(nèi)毒素血癥作用。 結(jié)果 白芷正丁醇萃取部位抗炎、 抗內(nèi)毒素血癥作用最強(qiáng)， 其色譜峰為歐前胡素 （8號峰）、 氧化前胡素 （9 號峰）、 異歐前胡素 （12 號峰） 及兩個(gè)未知成分。 結(jié)論 10 批不同產(chǎn)地白芷的正丁醇萃取部位均能明顯延長內(nèi)毒素血癥小鼠的存活時(shí)間，說明白芷抗內(nèi)毒素血癥譜效關(guān)系成立。

白芷;內(nèi)毒素血癥;指紋圖譜;譜效關(guān)系

內(nèi)毒素血癥是由于血中細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌釋放出大量內(nèi)毒素至血液，或輸入大量內(nèi)毒素污染的液體而引起。細(xì)菌內(nèi)毒素具有十分復(fù)雜的生物學(xué)活性，內(nèi)毒素血癥可引起一系列病理生理改變，包括膿毒癥、休克、 彌散性血管內(nèi)凝血 （DIC）、 多器官功能障礙綜合征 （MODS） 等。 經(jīng)典的抗感染和支持治療如抗生素的應(yīng)用、抗內(nèi)毒素抗體的應(yīng)用等并不能有效地清除內(nèi)毒素，反而具有一定的負(fù)面影響;而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在此方面具有獨(dú)特的功效，中藥在預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥方面有著很大的潛力和美好的前景［1］。

白芷為傘 形 科 植物 Angelica dahurica （ Fisch. ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.或 杭 白 芷 Angelica dahurica （ Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.F. Var.formosana （ Boiss.） Shan et Yuan 的干 燥根;辛， 溫; 歸胃、 大腸、 肺經(jīng)［2］。 白芷具 有抗菌作用，對多種細(xì)菌，如大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、霍亂桿菌、人型結(jié)核桿菌、 金黃 色 葡 萄 球 菌 等 均 有 抑 制 作 用［3］。 Song等［4］研究證明白芷提取物提前 30 min 腹腔注射給藥能對抗小鼠注射 LPS 或 D-GalN （ N-乙酰半乳糖胺） 產(chǎn)生的內(nèi)毒素血癥，使血漿中 TNF-α水平顯著降低，有對抗內(nèi)毒素作用。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)白芷醇提液具顯著的抗內(nèi)毒素血癥作用。為了整體有效反映白芷抗內(nèi)毒素血癥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對白芷醇提液進(jìn)行系統(tǒng)溶劑提取，對其抗內(nèi)毒素血癥有效部位進(jìn)行考察， 并采用 HPLC對白芷抗內(nèi)毒素血癥活性有效部位的指紋圖譜進(jìn)行了初步研究， 并運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法將藥效學(xué)信息與 HPLC指紋圖譜化學(xué)信息進(jìn)行相關(guān)性研究，以期表征白芷的抗內(nèi)毒素血癥效應(yīng)組分，為白芷抗內(nèi)毒素血癥活性成分的研究提供思路，為探討譜效相關(guān)性奠定基礎(chǔ)［5］。

1 儀器與材料

1.1 儀器 試劑 SHIMADZU LC-6AD型 HPLC儀、SPD-20A型紫外檢測器 （日本島津公司）; 色譜柱Lichrospher5-C18（250 mm×4.6 mm） （江蘇漢邦科技有限公司）;721 紫外分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）; 石油醚 （批號 20100306）、 乙酸乙酯 （批號 20100508）、 正丁 醇 （ 批 號 20100410）為分析純， 甲醇 （批號 20100521） 為色譜純， 均由天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。熱毒平顆粒（江西 鐘 山 藥 業(yè) 有 限 責(zé) 任 公 司， 國 藥 準(zhǔn) 字Z20063056）。 歐前胡素， 異歐前胡素 （ 上海友思生 物 技 術(shù) 有 限 公 司， 批 號 分 別 為 091028，101123）。氧化前胡素對照品 （廣州威佳科技有限公司， 批號 100324）。 BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀 （天大天發(fā)公司）; 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 （湛江博康海洋生物有限公司， 批號 130723）; 鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司， 批號 130423）; 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 （湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)， 批號 130521）。

1.2 試藥 10 批白芷藥材產(chǎn)地為: 河南孟州（S1）; 四川達(dá)縣 （S2）; 河北安國 （S3）; 四川遂寧 GAP基地 （ S4）; 浙江磐安 （S5）; 河南長葛（S6）; 安徽亳州 （S7）; 河南禹州 （S8）; 四川永勝 GAP基地 （S9）; 四川南川 （S10）。 由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室呂潔麗博士鑒定均為白芷 Angelica dahurica （Fisch.Ex Hoffm.） Benth.et Hook 的干燥根。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠， 體質(zhì)量 18 ～22 g， 4 周齡， SPF級， 購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室， 生產(chǎn)許可證號:SCKX魯 20080003。

2 方法

2.1 白芷抗內(nèi)毒素血癥有效部位的篩選

2.1.1 供試品的制備 取 S4 白芷1 kg， 加入60%乙醇2 L， 回流提取1 h， 提取2 次， 合并兩次的提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，即分別得到各不同極性提取部位。揮干各提取物中殘留溶劑，分別加入適量吐溫 -80， 待提取物溶解， 加水配制成 100 mL溶液， 使 1 mL藥液相當(dāng)于原藥材10 g中所含該類成分， 備用。

2.1.2 白芷不同提取部位對腹腔注射醋酸 （HAc）所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響實(shí)驗(yàn)［6］取小鼠50 只， 雌雄各半， 隨機(jī)分為 5 組， 0.5%吐溫 -80 對照組， 白芷石油醚部位組、 乙酸乙酯部位組、 正丁醇部位組， 水提部位組， 每組10只。各組均灌胃給藥 （相當(dāng)于原生藥 25 g/kg）， 連續(xù)給藥7 d， 每日1次。 末次給藥1 h后尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)各 4 mg/kg， 并立即于腹腔內(nèi)注射0.6%冰醋酸 0.01 mL/g。 20 min 后處死動(dòng)物， 剖開腹腔， 每次用2 mL蒸餾水沖洗腹腔，沖洗3次，收集洗出液 5 m L， 以蒸餾水作參比在 590 nm處測定吸收度值。

2.1.3 白芷不同提取部位對小鼠注射性內(nèi)毒素血癥模型的影響實(shí)驗(yàn)［6-7］取小鼠 60 只， 雌雄 各半，隨機(jī)分為6 組， 分別為 0.5%吐溫 -80 對照組， 陽性對照組 （熱毒平顆粒 3 g/kg）， 白芷石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水提部位組， 每組10 只。 各組均灌胃給藥 （相當(dāng)于原生藥25 g/kg）， 連續(xù)給藥 7 d， 每日 1 次。 末次給藥后0.5 h， 各組小鼠均腹腔注射內(nèi)毒素溶液 +D-氨基半乳糖溶液 ［（LPS， 15 mg/kg） + （D-GalN， 0.6 g/kg） 溶于生理鹽水］， 記錄小鼠 72 h 之內(nèi)的存活時(shí)間。

2.1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 （） 表示，采用 SPSS 19.0 軟件 進(jìn)行 t檢驗(yàn)， 以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 白芷抗內(nèi)毒素血癥有效部位 （正丁醇部位）指紋圖譜的研究

2.2.1 10 批白芷正丁醇部位供試液的制備 分別取 10 批不同產(chǎn)地白芷藥材樣品粉末 20 g， 加 6 倍量 60%乙醇回流提取2 次， 每次 1 h， 合并兩次提取液，先用環(huán)己烷、乙酸乙酯萃取，去除低極性化學(xué)成分，再正丁醇萃取，即得白芷正丁醇部位供試液。收集正丁醇液，減壓濃縮得干膏，殘?jiān)状既芙舛ㄈ葜?20 m L， 從中取 250 μL用甲醇稀釋至7.5 mL， 過 0.45 μm微孔濾膜， 供 HPLC分析。

2.2.2 色譜條件 柱溫 30 ℃， 流動(dòng)相 0 ～15min，5%甲醇 ～30%甲醇，15 ～25 min， 30% ～80%甲醇， 25 ～30 min， 80%甲醇， 30 ～40 min， 80% ～90%甲醇， 波長 254 nm， 體積流量 1 m L/min。

2.2.3 方法學(xué)考察 ①精密度實(shí)驗(yàn) 將同一白芷正丁醇部位供試液，按以上色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣5次，應(yīng)用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件，以其中一張為參照譜圖，計(jì)算其余4張譜圖與它的相似度。5 次譜圖的全圖譜相關(guān)系數(shù)均 99%以上，相似度良好，儀器精密度良好。②重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取白芷藥材等量 5 份， 按 “2.2.1” 項(xiàng)方法，制備供試品溶液，按以上確定的色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣，應(yīng)用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件，以其中一張為參照譜圖，計(jì)算其余四張譜圖與它的相似度。5張譜圖的全圖譜相關(guān)系數(shù)均99%以上， 說明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性較好。 ③穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取正丁醇部位供試品溶液，按以上色譜條件進(jìn)行測定， 一天內(nèi)分別在 0、 2、 4、 12、24 h 連續(xù)進(jìn)樣5次，應(yīng)用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件，以其中一張為參照譜圖，計(jì)算其余四張譜圖與它的相似度。5 張譜圖的全圖譜相關(guān)系數(shù)均 99%以上，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.4 白芷正丁醇部位指紋圖譜的測定 根據(jù)“2.2.2” 項(xiàng)色譜條件， 對 10 批不同來源的白芷藥材的正丁醇部位提取物進(jìn)行測定， 記錄 40 min 色譜圖。通過比較各色譜圖，以中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng) 2004 A版相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行匹配分析，按照中位數(shù)法建立各樣品的對照指紋圖譜。

2.3 10 批不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位抗內(nèi)毒素血癥作用的檢測

2.3.1 10 批白芷正丁醇部位樣品溶液的制備 方法同 “2.2.1” 項(xiàng)， 正丁醇提取液減壓濃縮得干膏， 加入適量吐溫 -80，待提取物溶解， 加水配制成 100 mL溶液，使 1 mL藥液相當(dāng)于原藥材 10 g中所含該類成分，無菌濾過，濾液于4℃保存?zhèn)溆?，即得?/p>

2.3.2 小鼠抗內(nèi)毒素血癥作用研究 小鼠 120 只，隨機(jī)分成 12 組， 吐溫 -80 對照組、 陽性組 （熱毒平顆粒 3 g/kg）， 10 批不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位組，每組10只， 均灌胃給藥， 白芷正丁醇部位給藥劑量25 g/kg（相當(dāng)于原生藥）， 連續(xù)給藥 7 d， 每日 1次。 末次給藥后0.5 h， 各組小鼠腹腔注射內(nèi)毒素溶液 （LPS， 15 mg/kg） 和 D-氨基半乳糖溶液 （DGalN， 0.6 g/kg）， 記錄小鼠 72 h 之內(nèi)的存活時(shí)間。

2.4 白芷抗內(nèi)毒素血癥作用與正丁醇部位 HPLC指紋圖譜的譜-效相關(guān)性分析

2.4.1 多元回歸分析 用 10 個(gè)不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位圖譜的數(shù)據(jù)來建立方程， 自變量 （X） 為 13個(gè)共有峰的量化峰面積 （X1-X13）， 因變量 （ Y）為小鼠72 h 之內(nèi)的存活時(shí)間。 使用軟件 SPSS19.0，采用逐步后退法建立方程。

2.4.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析［8-9］灰色系統(tǒng)是指部分信息已知而部分信息未知的系統(tǒng)，灰色系統(tǒng)理論所要考察和研究的是信息不完備的系統(tǒng)，通過已知信息來研究和預(yù)測未知領(lǐng)域從而達(dá)到了解整個(gè)系統(tǒng)的目的?；疑到y(tǒng)理論與概率論、模糊數(shù)學(xué)一起并稱為研究不確定性系統(tǒng)的三種常用方法，具有能夠利用“少數(shù)據(jù)” 建模尋求現(xiàn)實(shí)規(guī)律的良好特性， 克服了數(shù)據(jù)不足或系統(tǒng)周期短的矛盾。

灰色關(guān)聯(lián)分析過程:

做關(guān)聯(lián)分析先要指定參考數(shù)據(jù)列。參考數(shù)據(jù)列常記為 x0，記第 1 個(gè)時(shí)刻的為 x0（1），第 2 個(gè)時(shí)刻的值為 x0（2），第 k個(gè)時(shí)刻的值為 x0（k）。 因此，參考序列 x0可表示為 x0=（x0（1），x0（2），L x0（n））

關(guān)聯(lián)分析中被比較數(shù)列常記為 x1，x2，L，xk，類似參考序列 x0的表示方法，有 x1=（x1（1），x1（2），L，x1（n）），L，xk=（xk（1），xk（2），L，xk（n））

①求各序列的初值象。

每一個(gè)數(shù)列的第一個(gè)數(shù) xi，除其它數(shù) xi（k），這樣既可使數(shù)列無量綱又可得到公共交點(diǎn) xi（1）即第1點(diǎn)。

②求差序列。 各個(gè)時(shí)刻 xi與 x0的絕對差

③求兩極最大差和最小差。記

ζ是分辨系數(shù)，一般在0與1之間選取。

⑥排關(guān)聯(lián)序 將m個(gè)子序列對同一母序列的關(guān)聯(lián)度按大小順序排列起來，便組成關(guān)聯(lián)序，記為｛X}， 它直接反映各個(gè)子序列對母序列的貢獻(xiàn)的大小，據(jù)此可尋找指紋特征峰對應(yīng)的化學(xué)成分與藥效間的聯(lián)系。

2.5 與抗內(nèi)毒素血癥作用關(guān)聯(lián)性較大的色譜峰（即主要具有抗內(nèi)毒素血癥作用色譜峰） 所對應(yīng)物質(zhì)抗內(nèi)毒素作用的初步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)［10]

2.5.1 樣品液配制 將與抗內(nèi)毒素血癥作用關(guān)聯(lián)性較大的色譜峰所對應(yīng)成分且已用標(biāo)準(zhǔn)品對照鑒定出來的物質(zhì)，分別加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成1 mg/mL溶液， pH 6.5 ～7.0， 煮沸消毒 1 h。

2.5.2 抗內(nèi)毒素檢測 將凍干細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品加 12 mL鱟試劑溶解水， 使內(nèi)毒素濃度為10 EU/mL， 分別取 0.5 mL加入已有 0.5 mL各化合物無菌液試管內(nèi)， 振搖均勻， （ 55 ±2）℃ 溫育30 min， 分別取 0.2 mL加入 0.1 mL鱟試劑中， 同時(shí)作陽性、陰性對照 （雙管法）， 超聲振蕩 15 s，置細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀中于 （37 ±1）℃ 孵化 1 h，輕輕取出平放，觀察反應(yīng)情況。反應(yīng)液澄清或稍有混濁但傾斜試管可流動(dòng)者判為有抗內(nèi)毒素作用。

3 結(jié)果

3.1 白芷抗內(nèi)毒素血癥有效部位的篩選結(jié)果

3.1.1 白芷不同提取部位對腹腔注射醋酸 （HAc）所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響 由表1可見， 與吐溫 -80 對照組相比，白芷各不同提取部位對醋酸導(dǎo)致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高均有抑制作用， 其中正丁醇提取部位作用最強(qiáng) （P＜0.01）。

表1 白芷不同提取部位對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 （）Tab.1 Extracts of Angelica dahurica on m ice’ s abdom inal capillary permeability （）

表1 白芷不同提取部位對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 （）Tab.1 Extracts of Angelica dahurica on m ice’ s abdom inal capillary permeability （）

注: 與吐溫 -80 對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量 /（ 原生藥 g/kg） 動(dòng)物數(shù)/只 OD值吐溫 -80 對照組10 1.52 ±0.42石油醚部位組 25 10 0.87 ±0.52*乙酸乙酯部位組 25 10 0.79 ±0.25*正丁醇部位組 25 10 0.58 ±0.14**水提部位組 25 10 0.92 ±0.48 -*

3.1.2 白芷不同提取部位對小鼠注射性內(nèi)毒素模型的影響 由表2 可見， 與吐溫 -80 對照組相比，白芷各不同提取部位對注射 LPS 和 D-GalN產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間均有延長作用，其中正丁醇提取部位作用最強(qiáng) （P＜0.01）。

表 2 白芷不同提取部 位對注 射 LPS和 D-GalN產(chǎn) 生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間的影響 （）Tab.2 Extracts of Angelica dahurica on the survival tim e of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN） （）

表 2 白芷不同提取部 位對注 射 LPS和 D-GalN產(chǎn) 生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間的影響 （）Tab.2 Extracts of Angelica dahurica on the survival tim e of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN） （）

注: 與吐溫 -80 對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

/min吐溫 -80 對照組組別 劑量 /（ 原生藥 g/kg） 動(dòng)物數(shù)/只 生存時(shí)間10 752.2 ±19.3陽性對照組 3（成藥） 10 1198.5 ±24.7**石油醚部位組 25 10 975.3 ±38.9*乙酸乙酯部位組 25 10 986.3 ±37.4*正丁醇部位組 25 10 1168.9 ±31.8**水提部位組-25 10 856.0 ±28.9

3.2 白芷正丁醇部位對照指紋圖譜的建立 以中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng) 2004 A版相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行匹配分析，按照中位數(shù)法建立各樣品的對照指紋圖譜， 共 13 個(gè)共有峰， 結(jié)果見圖1。 與標(biāo)準(zhǔn)品對照可知8號為歐前胡素、 9號為氧化前胡素、 12 號峰為異歐前胡素 （見圖 2）。10 批白芷正丁醇部位 HPLC指紋圖譜疊加圖， 見圖3。

圖1 各樣品的對照指紋圖譜Fig.1 Chromatographic peaks of reference sam ple standards

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品圖Fig.2 M ixed standards

圖 3 10 批白芷正丁醇部位 HPLC指紋圖譜疊加圖 HPLCFig.3 Chromatographic overlapping of the n-butanol extract（ten batches）

3.3 10 批不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位抗內(nèi)毒素血癥作用的檢測 10 批不同產(chǎn)地白芷 （S1-S10） 正丁醇部位提取物均能明顯延長注射 LPS 和 D-GalN產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥小鼠的存活時(shí)間 （P＜0.05 ～0.01），其中 S2、 S3、 S4、 S5、 S8、 S10 抗內(nèi)毒素血癥作用較強(qiáng) （P＜0.01）。 結(jié)果見表 3。

表 3 10 批 不 同 產(chǎn)地白芷 正 丁醇部位 對 注 射 LPS和 DGalN產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間的影響 （）Tab.3 Extracts of Angelica dahurica on the survival time of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN （ ten batches）（）

表 3 10 批 不 同 產(chǎn)地白芷 正 丁醇部位 對 注 射 LPS和 DGalN產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間的影響 （）Tab.3 Extracts of Angelica dahurica on the survival time of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN （ ten batches）（）

注: 與吐溫 -80 對照組比較，*P＜0.05 ，**P＜0.01; 另:10批不同產(chǎn)地白芷藥材編號依次為 S1-S10

/min 5%吐溫-80 對照組組別 劑量 /（ 原生藥 g/kg） 動(dòng)物數(shù)/只 生存時(shí)間10 761.5 ±28.4陽性對照組 3（ 成藥） 10 1 241.5 ±37.5**S1 25 10 964.9 ±31.8*S2 25 10 1 061.5 ±28.4**S3 25 10 1 162.9 ±33.8**S4 25 10 1 232.9 ±24.8**S5 25 10 1 242.9 ±34.8**S6 25 10 992.9 ±24.8*S7 25 10 1 012.9 ±42.8*S8 25 10 1 082.9 ±31.8**S9 25 10 972.9 ±39.8*S10 25 10 1 142.9 ±35.8 -**

3.4 白芷抗內(nèi)毒素血癥作用與 HPLC指紋圖譜的譜-效相關(guān)性分析

3.4.1 多元回歸分析結(jié)果 自變量 （ X） 為 13 個(gè)共有峰的量化峰面積 （X1-X13） ， 因變量 （ Y） 為小鼠 72 h 之內(nèi)的死亡時(shí)間。 使用軟件 SPSS 19.0，采用逐步后退法建立方程。得到的方程為 Y= 7.137-0.02X1+0.058X2-0.041X3-0.298X4-0.102X5-0.019X7+0.123X8+0.063X9+ 0.002X11+0.031X12可看出共同被引入方程的是 1、2、 3、 4、 5、 7、8、 9、11、 12 號峰， 其中與延長小鼠72 h之內(nèi)的存活時(shí)間 （抗內(nèi)毒素血癥作用）具有正相關(guān)的色譜峰為 2、 8、 9、 11、 12 號峰， 負(fù)相關(guān)色譜峰為 1、 3、 4、 5、 7 號峰。

3.4.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果 由表 4 可看出通過將 10 個(gè)批次白芷的 13 個(gè)共有色譜峰與其相應(yīng)引起小鼠 72 h之內(nèi)的存活時(shí)間相關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)， 關(guān)聯(lián)度X11＞X8＞X5＞X12＞ X9＞ X2＞ X4＞ X13＞ X3＞X10＞ X7＞ X1＞ X6。 與多元回歸分析結(jié)果結(jié)合分析， 可綜合得出， 2、 8、 9、 11、 12 號峰是與抗內(nèi)毒素血癥作用關(guān)聯(lián)性較大的正相關(guān)色譜峰 （其中關(guān)聯(lián)度11 ＞8 ＞12 ＞9 ＞2），即主要具有抗內(nèi)毒素血癥作用，其中8號為歐前胡素、9號為氧化前胡素、 12 號峰為異歐前胡素， 色譜峰 2 和 11 具體成分與結(jié)構(gòu)尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

表 4 白芷正丁醇部位指紋圖譜共有峰與 72 h小鼠存活時(shí)間關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab.4 Connection of comm on peaks of the n-butanol extract and 72-hour survival tim e for endotoxem icm ice

3.5 與抗內(nèi)毒素血癥作用關(guān)聯(lián)性較大的色譜峰所對應(yīng)物質(zhì)抗內(nèi)毒素作用的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 所加異歐前胡素、氧化前胡素試管反應(yīng)液澄清，歐前胡素試管反應(yīng)液稍有混濁但傾斜試管可流動(dòng)。由此可見歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素均有體外抗內(nèi)毒素作用。

4 討論

中藥的功效，并不是單個(gè)化學(xué)成分，而是藥材飲片或成藥制劑內(nèi)所含有效物質(zhì)整體作用的結(jié)果。中藥指標(biāo)成分的控制，難以真正反映和評價(jià)中藥的藥效，需要對物質(zhì)群整體進(jìn)行控制。 中藥指紋圖譜采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)最大限度地獲取有用的化學(xué)信息，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的理論與方法，進(jìn)行數(shù)據(jù)解析和特征信息的提取，合理量化、優(yōu)化指紋圖譜。 中藥指紋圖譜能夠反映中藥單藥及復(fù)方“多組分多靶點(diǎn)的整合調(diào)節(jié)作用”的特點(diǎn)，它以“識別指紋圖譜”的表現(xiàn)形式來控制中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量。盡管中藥指紋圖譜方法采用多指標(biāo)比對的方法控制中藥質(zhì)量，被認(rèn)為整體地控制了中藥的物質(zhì)群體，但是單純的化學(xué)指紋圖譜并不能很準(zhǔn)確地評價(jià)中藥的成分與其藥效之間存在的相關(guān)聯(lián)系。而建立在中藥指紋圖譜基礎(chǔ)之上的中藥指紋圖譜譜效相關(guān)性研究，將標(biāo)示活性成分群特征峰的中藥指紋圖譜與藥效結(jié)果對應(yīng)起來，將中藥指紋圖譜中化學(xué)成分的變化與中藥藥效結(jié)果聯(lián)系起來，建立中藥譜效關(guān)系，反映中藥復(fù)方制劑內(nèi)在質(zhì)量［11-12］。 建立譜-效模型，將藥效學(xué)信息與化學(xué)指紋圖譜信息進(jìn)行相關(guān)性研究，尋找與藥效相關(guān)的指紋峰或成分群，有利于中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選和中藥質(zhì)量有效性控制，是尋找中藥活性成分一種新思路。

在建立中藥譜-效相關(guān)關(guān)系方面，有多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法［13］，包括主成分回歸分析、相關(guān)分析、典型相關(guān)分析、多元線性回歸分析、逐步回歸分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、聚類分析等，其中回歸分析是一種較通用也常用的方法，但是由于將分析的所有變量一次性全部引入進(jìn)行分析，因同時(shí)引入的變量較多，使各因素的影響變小，掩蓋了主要因素的作用，使其不能通過顯著性檢驗(yàn)，從而難以保證兩者關(guān)聯(lián)的準(zhǔn)確性。 本實(shí)驗(yàn)采用逐步后退回歸法［13］46，它能最大程的的保留有貢獻(xiàn)的變量，但無法同時(shí)反映所保留各個(gè)變量與因變量的相關(guān)程度的大小。

近年來，灰關(guān)聯(lián)度方法也逐漸用于研究中藥指紋圖譜與 其藥 效 學(xué) 之間 的 關(guān) 系［14-16］。 灰關(guān) 聯(lián) 分 析是灰色系統(tǒng)理論的一種新的分析方法，是根據(jù)因素之間發(fā)展趨勢的相似或相異程度，亦即“灰色關(guān)聯(lián)度”，作為衡量因素間關(guān)聯(lián)程度的一種方法。 灰色關(guān)聯(lián)分析方法可描述系統(tǒng)發(fā)展過程中因素間相對變化的情況，如果二者在發(fā)展過程中的相對變化基本一致，則認(rèn)為二者關(guān)聯(lián)度大，反之，則認(rèn)為二者關(guān)聯(lián)度就小。由于灰色關(guān)聯(lián)分析就是通過對序列幾何關(guān)系來比較系統(tǒng)中多因素關(guān)系的緊密程度，其緊密程度可由序列曲線的幾何形狀接近（或相近）程度來度量。序列曲線的幾何形狀接近程度的存在兩個(gè)方面的差異，一個(gè)是序列曲線正相關(guān)，一個(gè)是序列曲線負(fù)相關(guān)，對于正相關(guān)和負(fù)相關(guān)僅僅通過關(guān)聯(lián)系數(shù)無法反映。

本研究同時(shí)運(yùn)用多元回歸和灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)合方法將藥效學(xué)信息與 HPLC指紋圖譜化學(xué)信息進(jìn)行相關(guān)性研究，綜合得出 2、8、9、11、12 號峰是與抗內(nèi)毒素血癥作用正相關(guān)色譜峰（8 號為歐前胡素、9 號為氧化前胡素、12 號峰為異歐前胡素）。 并對歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素體外抗內(nèi)毒素作用進(jìn)行了初步驗(yàn)證，結(jié)果歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素均有體外抗內(nèi)毒素作用。 色譜峰2 和11具體成分與結(jié)構(gòu)及抗內(nèi)毒素作用尚待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究通過對白芷進(jìn)行“譜-效” 相關(guān)性的分析，建立了一種能夠使其圖譜和藥效相對應(yīng)和統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的模式。這僅僅是對白芷譜效學(xué)的嘗試性研究，初步表征了白芷抗內(nèi)毒素血癥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，今后仍需要大量的驗(yàn)證和進(jìn)一步的研究。

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The fingerprint-pharmacology of Angelica dahurica to endotoxem ia

ZHANG Hui1， HAIGuang-fan1， LIZhi-yong2， ZHANG Ting3， LüJie-li4*
（ 1.College of Pharmacy of Pharmacology Teaching and Research Section， Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003， China;2.Department of Cerebral Surgery， The Third People's Hospital of Anyang City， Anyang 455000， China;3.Sanquan Medical College， Xinxiang Medical University，Xingxiang 453003， China;4.Collegeof Pharmacy of ChineseMateria Medica Section， Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003， China）

AIM To study the active constituents in Angelica dahurica against endotoxemia.METHODSThe petroleum ether，ethyl acetate， n-butanol， aqueous extracts from Angelica dahurica were obtained， their antiinflammation and anti-endotoxin experiments were carried out on the mouse model of capillary hyperpermeability caused by the injection of acetate acid and the endotoxemiamodel by the intra-abdominal injection of LPS and DGalN.RESULTS The n-butanol extract had the best anti-inflammation and anti-endotoxin effect on the mice. Their chromatographic peaks isolated were identified as imperatorin （ No.2） ， and oxypeucedanin （No.8） ， isoimperatorin （ No.9）.Two other substances remained unknown.CONCLUSION The fact that ten batches of Angelica dahurica n-butanol extract all extend the survival time of endotoxemic mice proves its profile of spectrumpharmacology.

Angelica dahurica;endotoxemia;fingerprint;spectrum-pharmacology relationship

R969.1

:A

1001-1528（2014）12-2491-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.011

2013-12-04

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目 （ 81202916 ）

張 慧 （ 1982—） ， 女， 碩 士， 講 師， 研 究 方 向: 中 藥 活 性 成 分 及 藥 效 學(xué) 研 究。 Tel:15565434721， E-mail:zhanghui12070300@163.com

*通信作者: 呂潔麗 （1980—） ， 女， 博士， 副教授， 研究方向: 中藥活性成分及藥效學(xué)研究。 Tel: （0373 ） 3029101， E-mail:ruoxin0371@163.com