張 慧, 海廣范, 栗志勇, 張 婷, 呂潔麗

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院藥理學教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.安陽市三醫(yī)院胸外科 河南 安陽 453000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院中藥學教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003）

[制 劑]

白芷中抗內毒素血癥有效組分的譜效關系

張 慧1, 海廣范1, 栗志勇2, 張 婷3, 呂潔麗4*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院藥理學教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.安陽市三醫(yī)院胸外科 河南 安陽 453000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院, 河南 新鄉(xiāng) 453003； 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院中藥學教研室, 河南 新鄉(xiāng) 453003）

目的 研究白芷抗內毒素血癥的有效活性成分。方法 采用腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高實驗和小鼠注射脂多糖+D-氨基半乳糖溶液所致內毒素血癥模型， 考察白芷的石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇、 水提部位的抗炎、 抗內毒素血癥作用。 結果 白芷正丁醇萃取部位抗炎、 抗內毒素血癥作用最強， 其色譜峰為歐前胡素 （8號峰）、 氧化前胡素 （9 號峰）、 異歐前胡素 （12 號峰） 及兩個未知成分。 結論 10 批不同產(chǎn)地白芷的正丁醇萃取部位均能明顯延長內毒素血癥小鼠的存活時間，說明白芷抗內毒素血癥譜效關系成立。

白芷;內毒素血癥;指紋圖譜;譜效關系

內毒素血癥是由于血中細菌或病灶內細菌釋放出大量內毒素至血液，或輸入大量內毒素污染的液體而引起。細菌內毒素具有十分復雜的生物學活性，內毒素血癥可引起一系列病理生理改變，包括膿毒癥、休克、 彌散性血管內凝血 （DIC）、 多器官功能障礙綜合征 （MODS） 等。 經(jīng)典的抗感染和支持治療如抗生素的應用、抗內毒素抗體的應用等并不能有效地清除內毒素，反而具有一定的負面影響;而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在此方面具有獨特的功效，中藥在預防和治療內毒素血癥方面有著很大的潛力和美好的前景［1］。

白芷為傘 形 科 植物 Angelica dahurica （ Fisch. ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.或 杭 白 芷 Angelica dahurica （ Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.F. Var.formosana （ Boiss.） Shan et Yuan 的干 燥根;辛， 溫; 歸胃、 大腸、 肺經(jīng)［2］。 白芷具 有抗菌作用，對多種細菌，如大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、霍亂桿菌、人型結核桿菌、 金黃 色 葡 萄 球 菌 等 均 有 抑 制 作 用［3］。 Song等［4］研究證明白芷提取物提前 30 min 腹腔注射給藥能對抗小鼠注射 LPS 或 D-GalN （ N-乙酰半乳糖胺） 產(chǎn)生的內毒素血癥，使血漿中 TNF-α水平顯著降低，有對抗內毒素作用。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)白芷醇提液具顯著的抗內毒素血癥作用。為了整體有效反映白芷抗內毒素血癥作用的物質基礎，本研究對白芷醇提液進行系統(tǒng)溶劑提取，對其抗內毒素血癥有效部位進行考察， 并采用 HPLC對白芷抗內毒素血癥活性有效部位的指紋圖譜進行了初步研究， 并運用數(shù)理統(tǒng)計方法將藥效學信息與 HPLC指紋圖譜化學信息進行相關性研究，以期表征白芷的抗內毒素血癥效應組分，為白芷抗內毒素血癥活性成分的研究提供思路，為探討譜效相關性奠定基礎［5］。

1 儀器與材料

1.1 儀器 試劑 SHIMADZU LC-6AD型 HPLC儀、SPD-20A型紫外檢測器 （日本島津公司）; 色譜柱Lichrospher5-C18（250 mm×4.6 mm） （江蘇漢邦科技有限公司）;721 紫外分光光度計 （上海光譜儀器有限公司）; 石油醚 （批號 20100306）、 乙酸乙酯 （批號 20100508）、 正丁 醇 （ 批 號 20100410）為分析純， 甲醇 （批號 20100521） 為色譜純， 均由天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠生產(chǎn)。熱毒平顆粒（江西 鐘 山 藥 業(yè) 有 限 責 任 公 司， 國 藥 準 字Z20063056）。 歐前胡素， 異歐前胡素 （ 上海友思生 物 技 術 有 限 公 司， 批 號 分 別 為 091028，101123）。氧化前胡素對照品 （廣州威佳科技有限公司， 批號 100324）。 BET-48G細菌內毒素檢測儀 （天大天發(fā)公司）; 細菌內毒素工作標準品 （湛江博康海洋生物有限公司， 批號 130723）; 鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司， 批號 130423）; 細菌內毒素檢查用水 （湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)， 批號 130521）。

1.2 試藥 10 批白芷藥材產(chǎn)地為: 河南孟州（S1）; 四川達縣 （S2）; 河北安國 （S3）; 四川遂寧 GAP基地 （ S4）; 浙江磐安 （S5）; 河南長葛（S6）; 安徽亳州 （S7）; 河南禹州 （S8）; 四川永勝 GAP基地 （S9）; 四川南川 （S10）。 由新鄉(xiāng)醫(yī)學院中藥學教研室呂潔麗博士鑒定均為白芷 Angelica dahurica （Fisch.Ex Hoffm.） Benth.et Hook 的干燥根。

1.3 動物 昆明種小鼠， 體質量 18 ～22 g， 4 周齡， SPF級， 購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物室， 生產(chǎn)許可證號:SCKX魯 20080003。

2 方法

2.1 白芷抗內毒素血癥有效部位的篩選

2.1.1 供試品的制備 取 S4 白芷1 kg， 加入60%乙醇2 L， 回流提取1 h， 提取2 次， 合并兩次的提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，即分別得到各不同極性提取部位。揮干各提取物中殘留溶劑，分別加入適量吐溫 -80， 待提取物溶解， 加水配制成 100 mL溶液， 使 1 mL藥液相當于原藥材10 g中所含該類成分， 備用。

2.1.2 白芷不同提取部位對腹腔注射醋酸 （HAc）所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響實驗［6］取小鼠50 只， 雌雄各半， 隨機分為 5 組， 0.5%吐溫 -80 對照組， 白芷石油醚部位組、 乙酸乙酯部位組、 正丁醇部位組， 水提部位組， 每組10只。各組均灌胃給藥 （相當于原生藥 25 g/kg）， 連續(xù)給藥7 d， 每日1次。 末次給藥1 h后尾靜脈注射1%伊文思藍各 4 mg/kg， 并立即于腹腔內注射0.6%冰醋酸 0.01 mL/g。 20 min 后處死動物， 剖開腹腔， 每次用2 mL蒸餾水沖洗腹腔，沖洗3次，收集洗出液 5 m L， 以蒸餾水作參比在 590 nm處測定吸收度值。

2.1.3 白芷不同提取部位對小鼠注射性內毒素血癥模型的影響實驗［6-7］取小鼠 60 只， 雌雄 各半，隨機分為6 組， 分別為 0.5%吐溫 -80 對照組， 陽性對照組 （熱毒平顆粒 3 g/kg）， 白芷石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水提部位組， 每組10 只。 各組均灌胃給藥 （相當于原生藥25 g/kg）， 連續(xù)給藥 7 d， 每日 1 次。 末次給藥后0.5 h， 各組小鼠均腹腔注射內毒素溶液 +D-氨基半乳糖溶液 ［（LPS， 15 mg/kg） + （D-GalN， 0.6 g/kg） 溶于生理鹽水］， 記錄小鼠 72 h 之內的存活時間。

2.1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差 （） 表示，采用 SPSS 19.0 軟件 進行 t檢驗， 以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 白芷抗內毒素血癥有效部位 （正丁醇部位）指紋圖譜的研究

2.2.1 10 批白芷正丁醇部位供試液的制備 分別取 10 批不同產(chǎn)地白芷藥材樣品粉末 20 g， 加 6 倍量 60%乙醇回流提取2 次， 每次 1 h， 合并兩次提取液，先用環(huán)己烷、乙酸乙酯萃取，去除低極性化學成分，再正丁醇萃取，即得白芷正丁醇部位供試液。收集正丁醇液，減壓濃縮得干膏，殘渣甲醇溶解定容至 20 m L， 從中取 250 μL用甲醇稀釋至7.5 mL， 過 0.45 μm微孔濾膜， 供 HPLC分析。

2.2.2 色譜條件 柱溫 30 ℃， 流動相 0 ～15min，5%甲醇 ～30%甲醇，15 ～25 min， 30% ～80%甲醇， 25 ～30 min， 80%甲醇， 30 ～40 min， 80% ～90%甲醇， 波長 254 nm， 體積流量 1 m L/min。

2.2.3 方法學考察 ①精密度實驗 將同一白芷正丁醇部位供試液，按以上色譜條件進行測定，連續(xù)進樣5次，應用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件，以其中一張為參照譜圖，計算其余4張譜圖與它的相似度。5 次譜圖的全圖譜相關系數(shù)均 99%以上，相似度良好，儀器精密度良好。②重復性實驗 取白芷藥材等量 5 份， 按 “2.2.1” 項方法，制備供試品溶液，按以上確定的色譜條件進行測定，連續(xù)進樣，應用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件，以其中一張為參照譜圖，計算其余四張譜圖與它的相似度。5張譜圖的全圖譜相關系數(shù)均99%以上， 說明實驗方法重復性較好。 ③穩(wěn)定性實驗 取正丁醇部位供試品溶液，按以上色譜條件進行測定， 一天內分別在 0、 2、 4、 12、24 h 連續(xù)進樣5次，應用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件，以其中一張為參照譜圖，計算其余四張譜圖與它的相似度。5 張譜圖的全圖譜相關系數(shù)均 99%以上，說明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性較好。

2.2.4 白芷正丁醇部位指紋圖譜的測定 根據(jù)“2.2.2” 項色譜條件， 對 10 批不同來源的白芷藥材的正丁醇部位提取物進行測定， 記錄 40 min 色譜圖。通過比較各色譜圖，以中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 2004 A版相似度評價系統(tǒng)軟件進行匹配分析，按照中位數(shù)法建立各樣品的對照指紋圖譜。

2.3 10 批不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位抗內毒素血癥作用的檢測

2.3.1 10 批白芷正丁醇部位樣品溶液的制備 方法同 “2.2.1” 項， 正丁醇提取液減壓濃縮得干膏， 加入適量吐溫 -80，待提取物溶解， 加水配制成 100 mL溶液，使 1 mL藥液相當于原藥材 10 g中所含該類成分，無菌濾過，濾液于4℃保存?zhèn)溆茫吹谩?/p>

2.3.2 小鼠抗內毒素血癥作用研究 小鼠 120 只，隨機分成 12 組， 吐溫 -80 對照組、 陽性組 （熱毒平顆粒 3 g/kg）， 10 批不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位組，每組10只， 均灌胃給藥， 白芷正丁醇部位給藥劑量25 g/kg（相當于原生藥）， 連續(xù)給藥 7 d， 每日 1次。 末次給藥后0.5 h， 各組小鼠腹腔注射內毒素溶液 （LPS， 15 mg/kg） 和 D-氨基半乳糖溶液 （DGalN， 0.6 g/kg）， 記錄小鼠 72 h 之內的存活時間。

2.4 白芷抗內毒素血癥作用與正丁醇部位 HPLC指紋圖譜的譜-效相關性分析

2.4.1 多元回歸分析 用 10 個不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位圖譜的數(shù)據(jù)來建立方程， 自變量 （X） 為 13個共有峰的量化峰面積 （X1-X13）， 因變量 （ Y）為小鼠72 h 之內的存活時間。 使用軟件 SPSS19.0，采用逐步后退法建立方程。

2.4.2 灰色關聯(lián)度分析［8-9］灰色系統(tǒng)是指部分信息已知而部分信息未知的系統(tǒng)，灰色系統(tǒng)理論所要考察和研究的是信息不完備的系統(tǒng)，通過已知信息來研究和預測未知領域從而達到了解整個系統(tǒng)的目的?；疑到y(tǒng)理論與概率論、模糊數(shù)學一起并稱為研究不確定性系統(tǒng)的三種常用方法，具有能夠利用“少數(shù)據(jù)” 建模尋求現(xiàn)實規(guī)律的良好特性， 克服了數(shù)據(jù)不足或系統(tǒng)周期短的矛盾。

灰色關聯(lián)分析過程:

做關聯(lián)分析先要指定參考數(shù)據(jù)列。參考數(shù)據(jù)列常記為 x0，記第 1 個時刻的為 x0（1），第 2 個時刻的值為 x0（2），第 k個時刻的值為 x0（k）。 因此，參考序列 x0可表示為 x0=（x0（1），x0（2），L x0（n））

關聯(lián)分析中被比較數(shù)列常記為 x1，x2，L，xk，類似參考序列 x0的表示方法，有 x1=（x1（1），x1（2），L，x1（n）），L，xk=（xk（1），xk（2），L，xk（n））

①求各序列的初值象。

每一個數(shù)列的第一個數(shù) xi，除其它數(shù) xi（k），這樣既可使數(shù)列無量綱又可得到公共交點 xi（1）即第1點。

②求差序列。 各個時刻 xi與 x0的絕對差

③求兩極最大差和最小差。記

ζ是分辨系數(shù)，一般在0與1之間選取。

⑥排關聯(lián)序 將m個子序列對同一母序列的關聯(lián)度按大小順序排列起來，便組成關聯(lián)序，記為｛X}， 它直接反映各個子序列對母序列的貢獻的大小，據(jù)此可尋找指紋特征峰對應的化學成分與藥效間的聯(lián)系。

2.5 與抗內毒素血癥作用關聯(lián)性較大的色譜峰（即主要具有抗內毒素血癥作用色譜峰） 所對應物質抗內毒素作用的初步驗證實驗［10]

2.5.1 樣品液配制 將與抗內毒素血癥作用關聯(lián)性較大的色譜峰所對應成分且已用標準品對照鑒定出來的物質，分別加細菌內毒素檢查用水配制成1 mg/mL溶液， pH 6.5 ～7.0， 煮沸消毒 1 h。

2.5.2 抗內毒素檢測 將凍干細菌內毒素工作標準品加 12 mL鱟試劑溶解水， 使內毒素濃度為10 EU/mL， 分別取 0.5 mL加入已有 0.5 mL各化合物無菌液試管內， 振搖均勻， （ 55 ±2）℃ 溫育30 min， 分別取 0.2 mL加入 0.1 mL鱟試劑中， 同時作陽性、陰性對照 （雙管法）， 超聲振蕩 15 s，置細菌內毒素測定儀中于 （37 ±1）℃ 孵化 1 h，輕輕取出平放，觀察反應情況。反應液澄清或稍有混濁但傾斜試管可流動者判為有抗內毒素作用。

3 結果

3.1 白芷抗內毒素血癥有效部位的篩選結果

3.1.1 白芷不同提取部位對腹腔注射醋酸 （HAc）所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響 由表1可見， 與吐溫 -80 對照組相比，白芷各不同提取部位對醋酸導致小鼠腹腔毛細血管通透性增高均有抑制作用， 其中正丁醇提取部位作用最強 （P＜0.01）。

表1 白芷不同提取部位對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 （）Tab.1 Extracts of Angelica dahurica on m ice’ s abdom inal capillary permeability （）

表1 白芷不同提取部位對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 （）Tab.1 Extracts of Angelica dahurica on m ice’ s abdom inal capillary permeability （）

注: 與吐溫 -80 對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量 /（ 原生藥 g/kg） 動物數(shù)/只 OD值吐溫 -80 對照組10 1.52 ±0.42石油醚部位組 25 10 0.87 ±0.52*乙酸乙酯部位組 25 10 0.79 ±0.25*正丁醇部位組 25 10 0.58 ±0.14**水提部位組 25 10 0.92 ±0.48 -*

3.1.2 白芷不同提取部位對小鼠注射性內毒素模型的影響 由表2 可見， 與吐溫 -80 對照組相比，白芷各不同提取部位對注射 LPS 和 D-GalN產(chǎn)生內毒素血癥小鼠存活時間均有延長作用，其中正丁醇提取部位作用最強 （P＜0.01）。

表 2 白芷不同提取部 位對注 射 LPS和 D-GalN產(chǎn) 生內毒素血癥小鼠存活時間的影響 （）Tab.2 Extracts of Angelica dahurica on the survival tim e of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN） （）

表 2 白芷不同提取部 位對注 射 LPS和 D-GalN產(chǎn) 生內毒素血癥小鼠存活時間的影響 （）Tab.2 Extracts of Angelica dahurica on the survival tim e of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN） （）

注: 與吐溫 -80 對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

/min吐溫 -80 對照組組別 劑量 /（ 原生藥 g/kg） 動物數(shù)/只 生存時間10 752.2 ±19.3陽性對照組 3（成藥） 10 1198.5 ±24.7**石油醚部位組 25 10 975.3 ±38.9*乙酸乙酯部位組 25 10 986.3 ±37.4*正丁醇部位組 25 10 1168.9 ±31.8**水提部位組-25 10 856.0 ±28.9

3.2 白芷正丁醇部位對照指紋圖譜的建立 以中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 2004 A版相似度評價系統(tǒng)軟件進行匹配分析，按照中位數(shù)法建立各樣品的對照指紋圖譜， 共 13 個共有峰， 結果見圖1。 與標準品對照可知8號為歐前胡素、 9號為氧化前胡素、 12 號峰為異歐前胡素 （見圖 2）。10 批白芷正丁醇部位 HPLC指紋圖譜疊加圖， 見圖3。

圖1 各樣品的對照指紋圖譜Fig.1 Chromatographic peaks of reference sam ple standards

圖2 混合標準品圖Fig.2 M ixed standards

圖 3 10 批白芷正丁醇部位 HPLC指紋圖譜疊加圖 HPLCFig.3 Chromatographic overlapping of the n-butanol extract（ten batches）

3.3 10 批不同產(chǎn)地白芷正丁醇部位抗內毒素血癥作用的檢測 10 批不同產(chǎn)地白芷 （S1-S10） 正丁醇部位提取物均能明顯延長注射 LPS 和 D-GalN產(chǎn)生內毒素血癥小鼠的存活時間 （P＜0.05 ～0.01），其中 S2、 S3、 S4、 S5、 S8、 S10 抗內毒素血癥作用較強 （P＜0.01）。 結果見表 3。

表 3 10 批 不 同 產(chǎn)地白芷 正 丁醇部位 對 注 射 LPS和 DGalN產(chǎn)生內毒素血癥小鼠存活時間的影響 （）Tab.3 Extracts of Angelica dahurica on the survival time of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN （ ten batches）（）

表 3 10 批 不 同 產(chǎn)地白芷 正 丁醇部位 對 注 射 LPS和 DGalN產(chǎn)生內毒素血癥小鼠存活時間的影響 （）Tab.3 Extracts of Angelica dahurica on the survival time of endotoxem icm ice（ induced by the intra-abdom inal injection of LPS and D-GalN （ ten batches）（）

注: 與吐溫 -80 對照組比較，*P＜0.05 ，**P＜0.01; 另:10批不同產(chǎn)地白芷藥材編號依次為 S1-S10

/min 5%吐溫-80 對照組組別 劑量 /（ 原生藥 g/kg） 動物數(shù)/只 生存時間10 761.5 ±28.4陽性對照組 3（ 成藥） 10 1 241.5 ±37.5**S1 25 10 964.9 ±31.8*S2 25 10 1 061.5 ±28.4**S3 25 10 1 162.9 ±33.8**S4 25 10 1 232.9 ±24.8**S5 25 10 1 242.9 ±34.8**S6 25 10 992.9 ±24.8*S7 25 10 1 012.9 ±42.8*S8 25 10 1 082.9 ±31.8**S9 25 10 972.9 ±39.8*S10 25 10 1 142.9 ±35.8 -**

3.4 白芷抗內毒素血癥作用與 HPLC指紋圖譜的譜-效相關性分析

3.4.1 多元回歸分析結果 自變量 （ X） 為 13 個共有峰的量化峰面積 （X1-X13） ， 因變量 （ Y） 為小鼠 72 h 之內的死亡時間。 使用軟件 SPSS 19.0，采用逐步后退法建立方程。得到的方程為 Y= 7.137-0.02X1+0.058X2-0.041X3-0.298X4-0.102X5-0.019X7+0.123X8+0.063X9+ 0.002X11+0.031X12可看出共同被引入方程的是 1、2、 3、 4、 5、 7、8、 9、11、 12 號峰， 其中與延長小鼠72 h之內的存活時間 （抗內毒素血癥作用）具有正相關的色譜峰為 2、 8、 9、 11、 12 號峰， 負相關色譜峰為 1、 3、 4、 5、 7 號峰。

3.4.2 灰色關聯(lián)度分析結果 由表 4 可看出通過將 10 個批次白芷的 13 個共有色譜峰與其相應引起小鼠 72 h之內的存活時間相關聯(lián)發(fā)現(xiàn)， 關聯(lián)度X11＞X8＞X5＞X12＞ X9＞ X2＞ X4＞ X13＞ X3＞X10＞ X7＞ X1＞ X6。 與多元回歸分析結果結合分析， 可綜合得出， 2、 8、 9、 11、 12 號峰是與抗內毒素血癥作用關聯(lián)性較大的正相關色譜峰 （其中關聯(lián)度11 ＞8 ＞12 ＞9 ＞2），即主要具有抗內毒素血癥作用，其中8號為歐前胡素、9號為氧化前胡素、 12 號峰為異歐前胡素， 色譜峰 2 和 11 具體成分與結構尚待進一步研究證實。

表 4 白芷正丁醇部位指紋圖譜共有峰與 72 h小鼠存活時間關聯(lián)結果Tab.4 Connection of comm on peaks of the n-butanol extract and 72-hour survival tim e for endotoxem icm ice

3.5 與抗內毒素血癥作用關聯(lián)性較大的色譜峰所對應物質抗內毒素作用的驗證實驗結果 所加異歐前胡素、氧化前胡素試管反應液澄清，歐前胡素試管反應液稍有混濁但傾斜試管可流動。由此可見歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素均有體外抗內毒素作用。

4 討論

中藥的功效，并不是單個化學成分，而是藥材飲片或成藥制劑內所含有效物質整體作用的結果。中藥指標成分的控制，難以真正反映和評價中藥的藥效，需要對物質群整體進行控制。 中藥指紋圖譜采用色譜及其聯(lián)用技術最大限度地獲取有用的化學信息，同時結合化學計量學的理論與方法，進行數(shù)據(jù)解析和特征信息的提取，合理量化、優(yōu)化指紋圖譜。 中藥指紋圖譜能夠反映中藥單藥及復方“多組分多靶點的整合調節(jié)作用”的特點，它以“識別指紋圖譜”的表現(xiàn)形式來控制中藥復方制劑的質量。盡管中藥指紋圖譜方法采用多指標比對的方法控制中藥質量，被認為整體地控制了中藥的物質群體，但是單純的化學指紋圖譜并不能很準確地評價中藥的成分與其藥效之間存在的相關聯(lián)系。而建立在中藥指紋圖譜基礎之上的中藥指紋圖譜譜效相關性研究，將標示活性成分群特征峰的中藥指紋圖譜與藥效結果對應起來，將中藥指紋圖譜中化學成分的變化與中藥藥效結果聯(lián)系起來，建立中藥譜效關系，反映中藥復方制劑內在質量［11-12］。 建立譜-效模型，將藥效學信息與化學指紋圖譜信息進行相關性研究，尋找與藥效相關的指紋峰或成分群，有利于中藥活性物質基礎的篩選和中藥質量有效性控制，是尋找中藥活性成分一種新思路。

在建立中藥譜-效相關關系方面，有多種統(tǒng)計學方法［13］，包括主成分回歸分析、相關分析、典型相關分析、多元線性回歸分析、逐步回歸分析、灰色關聯(lián)度分析、聚類分析等，其中回歸分析是一種較通用也常用的方法，但是由于將分析的所有變量一次性全部引入進行分析，因同時引入的變量較多，使各因素的影響變小，掩蓋了主要因素的作用，使其不能通過顯著性檢驗，從而難以保證兩者關聯(lián)的準確性。 本實驗采用逐步后退回歸法［13］46，它能最大程的的保留有貢獻的變量，但無法同時反映所保留各個變量與因變量的相關程度的大小。

近年來，灰關聯(lián)度方法也逐漸用于研究中藥指紋圖譜與 其藥 效 學 之間 的 關 系［14-16］。 灰關 聯(lián) 分 析是灰色系統(tǒng)理論的一種新的分析方法，是根據(jù)因素之間發(fā)展趨勢的相似或相異程度，亦即“灰色關聯(lián)度”，作為衡量因素間關聯(lián)程度的一種方法。 灰色關聯(lián)分析方法可描述系統(tǒng)發(fā)展過程中因素間相對變化的情況，如果二者在發(fā)展過程中的相對變化基本一致，則認為二者關聯(lián)度大，反之，則認為二者關聯(lián)度就小。由于灰色關聯(lián)分析就是通過對序列幾何關系來比較系統(tǒng)中多因素關系的緊密程度，其緊密程度可由序列曲線的幾何形狀接近（或相近）程度來度量。序列曲線的幾何形狀接近程度的存在兩個方面的差異，一個是序列曲線正相關，一個是序列曲線負相關，對于正相關和負相關僅僅通過關聯(lián)系數(shù)無法反映。

本研究同時運用多元回歸和灰色關聯(lián)度結合方法將藥效學信息與 HPLC指紋圖譜化學信息進行相關性研究，綜合得出 2、8、9、11、12 號峰是與抗內毒素血癥作用正相關色譜峰（8 號為歐前胡素、9 號為氧化前胡素、12 號峰為異歐前胡素）。 并對歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素體外抗內毒素作用進行了初步驗證，結果歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素均有體外抗內毒素作用。 色譜峰2 和11具體成分與結構及抗內毒素作用尚待進一步研究驗證。

本研究通過對白芷進行“譜-效” 相關性的分析，建立了一種能夠使其圖譜和藥效相對應和統(tǒng)一的質量標準控制的模式。這僅僅是對白芷譜效學的嘗試性研究，初步表征了白芷抗內毒素血癥作用的物質基礎，今后仍需要大量的驗證和進一步的研究。

［ 1 ］ 王文江，姚詠明.中醫(yī)藥抗內毒素血癥治療的研究進展［J］.中國中西醫(yī)結合急救雜志，2004，9（11）:317-320.

［ 2 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:97.

［ 3 ］ Lechner D，Stavri M，Oluwatuyi M，et al.The anti-staphylococcal activity of Angelica dahurica （ BaiZhi） ［ J］ .Phytochemistry，2004， 65（3）:331-335.

［ 4 ］ Song D K，Kim JY，Li G， et al.Agents protecting against sepsis from the roots of Angelica dahurica［ J］ .Biol Pharm Bull，2005，28 （2）:380-382.

［ 5 ］ 陶金華，狄留慶，文紅梅，等.中藥指紋圖譜譜效相關性研究思路探討［ J］ .中國中藥雜志，2009，34（18） :2410-2413.

［ 6 ］ 陳 奇，鄧文龍，張世瑋，等.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:305-307.

［ 7 ］ MurakamiK， KobayashiF， Ikegawa R.Metalloproteinase inhibitor prevents hepatic injury in endotoxemic mice［ J］.Eur JPharmacol，1998，341（1） :105-110.

［ 8 ］ 孫芳芳.淺議灰色關聯(lián)度分析方法及其應用［J］.科技信息，2010，17（2）:364-366.

［ 9 ］ 陳思峰，黨耀國，方志耕，等.灰色系統(tǒng)理論及應用［M］.北京:科學出版社，2010:62-105.

［10］ 劉云海，陳永順，謝 委，等.柴胡總皂苷抗內毒素活性研究［J］.中藥材，2003，26（6）:423-426.

［11］ 李 戎，閆智勇，李文軍，等.創(chuàng)建中藥譜效關系學［J］.中醫(yī)教育，2002，21（2）:62.

［12］ 羅國安，王義明，曹 進，等.建立我國現(xiàn)代中藥質量標準體系的研究［ J］.世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2002，4 （4）: 5-11.

［13］ 陳 峰.醫(yī)用多元統(tǒng)計分析方法［M］.北京:中國統(tǒng)計出版社，2006:30.

［14］ 陶 紅，林慶鋒，張 韜，等.治療手足口病中藥的灰關聯(lián)分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（4）:282-284.

［15］ 劉瑜彬，王 暉，唐曉峰，等.灰關聯(lián)聚類法評價補中益氣湯對大鼠氣虛發(fā)熱的效果［ J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（18）:124-128.

［16］ 朱詩塔，雷 鵬，李新中，等.掌葉大黃不同炮制品指紋圖譜與其止血作用的灰關聯(lián)度分析［J］.中南藥學，2009，7（1）: 55-58.

The fingerprint-pharmacology of Angelica dahurica to endotoxem ia

ZHANG Hui1， HAIGuang-fan1， LIZhi-yong2， ZHANG Ting3， LüJie-li4*
（ 1.College of Pharmacy of Pharmacology Teaching and Research Section， Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003， China;2.Department of Cerebral Surgery， The Third People's Hospital of Anyang City， Anyang 455000， China;3.Sanquan Medical College， Xinxiang Medical University，Xingxiang 453003， China;4.Collegeof Pharmacy of ChineseMateria Medica Section， Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003， China）

AIM To study the active constituents in Angelica dahurica against endotoxemia.METHODSThe petroleum ether，ethyl acetate， n-butanol， aqueous extracts from Angelica dahurica were obtained， their antiinflammation and anti-endotoxin experiments were carried out on the mouse model of capillary hyperpermeability caused by the injection of acetate acid and the endotoxemiamodel by the intra-abdominal injection of LPS and DGalN.RESULTS The n-butanol extract had the best anti-inflammation and anti-endotoxin effect on the mice. Their chromatographic peaks isolated were identified as imperatorin （ No.2） ， and oxypeucedanin （No.8） ， isoimperatorin （ No.9）.Two other substances remained unknown.CONCLUSION The fact that ten batches of Angelica dahurica n-butanol extract all extend the survival time of endotoxemic mice proves its profile of spectrumpharmacology.

Angelica dahurica;endotoxemia;fingerprint;spectrum-pharmacology relationship

R969.1

:A

1001-1528（2014）12-2491-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.011

2013-12-04

國家自然科學基金青年基金項目 （ 81202916 ）

張 慧 （ 1982—） ， 女， 碩 士， 講 師， 研 究 方 向: 中 藥 活 性 成 分 及 藥 效 學 研 究。 Tel:15565434721， E-mail:zhanghui12070300@163.com

*通信作者: 呂潔麗 （1980—） ， 女， 博士， 副教授， 研究方向: 中藥活性成分及藥效學研究。 Tel: （0373 ） 3029101， E-mail:ruoxin0371@163.com