胡凱莉， 賈 娜， 劉 梅， 奉建芳

（上海中醫(yī)藥大學 穆拉德中藥現代化研究中心， 上海 201203）

多烯紫杉醇脂質核膠束的制備及性質考察

胡凱莉， 賈 娜， 劉 梅， 奉建芳*

（上海中醫(yī)藥大學 穆拉德中藥現代化研究中心， 上海 201203）

目的 采用正交試驗優(yōu)化多烯紫杉醇脂質核膠束的處方工藝并考察其質量。方法 以二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000(PEG-2000DSPE) 為載體材料, 通過薄膜水化法制備載多烯紫杉醇的脂質核膠束。 通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化確立了制劑的最優(yōu)處方工藝。以透射電鏡觀察載藥膠束的外觀形態(tài)；動態(tài)光散射法測定其粒徑；HPLC法測定載藥量； 以透析法進行體外釋放特性考察。 結果 透射電鏡下觀察多烯紫杉醇脂質核膠束呈外觀圓整的球形, 動態(tài)光散射法測定其粒徑為 (18.3 ±1.8)nm,Zeta電位為 (-17.20 ±6.46)mV, 載藥量為 3.1% ～4.1%；體外釋放試驗表明其具有一定的緩釋效應, 體外釋放曲線符合 Higuchi方程。 結論 通過處方優(yōu)化制得的多烯紫杉醇脂質核膠束,具有理想的粒徑,載藥量和體外釋放行為,有望提高多烯紫杉醇的抗腫瘤效果。

多烯紫杉醇；脂質核膠束；正交試驗；體外釋放

多烯紫杉醇 (Docetaxel,DTX) 是一種半合成的紫杉醇類抗腫瘤藥物,其抗腫瘤作用強,臨床用于治療非小細胞肺癌、乳腺癌等,單獨及聯(lián)合用藥均有顯著 療 效［1-3］。 但 多 烯 紫 杉 醇 水 溶 性 差, 目 前上市的注射劑以吐溫 -80 和乙醇作為溶媒, 臨床使用時常出現劇烈的過敏反應,需要聯(lián)合使用皮質激素［4］, 極大 的 限 制 了 其 進 一 步 應 用。 近 年 來,脂質核膠束 (Lipid-coremicelles) 在難溶性抗腫瘤藥物的包載和遞送中顯示出了獨特的優(yōu)勢。相對于其它微粒給藥系統(tǒng),脂質核膠束較小的粒徑能更有效的通過 EPR效應在腫瘤部位聚集。此外它還具有更好的穩(wěn)定性,且制備材料合成簡單,安全性好, 已有商業(yè)化的商品［5-6］。 本實驗通過薄 膜水化法制備多烯紫杉醇脂質核膠束,考察處方工藝因素對于制得膠束粒徑及載藥量的影響,采用正交試驗設計進行處方工藝優(yōu)化,并對優(yōu)化處方制得脂質核膠束的體外釋放行為進行考察,期望后期能通過注射給藥提高多烯紫杉醇的抗腫瘤效果。

1 儀器與材料

Shimadzu LC-20AD高 效 液 相 色 譜 系 統(tǒng) ( 日 本島津公司) ； C18色 譜 柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm (大連依 利 特 公 司)； Centrifuge 580R 低 溫 離 心 機( 德 國 Eppendorf公 司)； XW-80A 型 渦 旋 混 合 器(上海精科實業(yè)有限公司)； JEM-1230 透射電子顯微鏡 (日本 Joel公司)； AL204 電子天平 (梅特勒-托利多儀器有 限 公司)； RE-200 旋轉蒸 發(fā) 儀 ( 上海亞榮生物儀器廠)； XW-80A型渦旋混合器 (上海精科 實業(yè)有 限公司)；85-2 型 恒溫磁 力攪拌器(上 海 梅 穎 浦 公 司) ； Zetasizer Nano粒 度 測 定 儀(英國馬爾文公司)； THZ-C恒溫振蕩器 (太倉市實驗設備廠)；MODULYOD-230 冷凍干燥機 (美國Thermo公司)； 多烯紫杉醇 (DTX, 上海天偉生物制藥有限公司, 純度 99.7%, 批號 090501)； 二硬脂 酰 基 磷 脂 酰 乙 醇 胺-聚 乙 二 醇 2000(DPSEPEG2000, 日 本 Nippon Fine Chemical公 司)Tween 80、甲醇等 (國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純, 韓國 SK Chemical公司)； 水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 脂質核膠束的制備 采用薄膜水化法制備載多烯紫杉醇的 PEG-DSPE脂質核膠束 (DTX-M),將含1 mg多 烯 紫 杉 醇 甲 醇 溶 液 加 入 溶 解 有 15 mg PEG-DSPE的氯仿中混勻,38 ℃旋轉蒸發(fā)成膜。 冷凍干燥 12 h 除 去 痕 量 溶 劑［7］。 加 入 2 m L pH 7.4 HEPES 緩沖液水化。 產物用 0.2 μm的微孔濾膜過濾,即得。

2.2 脂質核膠束的處方工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗 以制得多烯紫杉醇-M的粒徑和載藥量為指標,分別考察制備過程中多烯紫杉醇和 PEG-DSPE的質量比, 成膜時間, 成膜溫度,凍干時間,水化介質體積和漩渦時間等因素對于多烯紫杉醇-M制備的影響。 各因素水平見表 1, 結果見圖1。

表1 單因素試驗的因素及水平Tab.1 Factors and levels of single factor test

由圖 1 中可以看出, 除了漩渦時間為 5 min 時制得多烯紫杉醇-M粒徑較大, 其余各因素對于多烯紫杉醇-M粒徑均無明顯影響, 膠束粒徑均在18 nm左右。而各因素對于制得多烯紫杉醇-M的載藥量均有一定的影響。結合文獻,考慮漩渦時間為10 min, 成膜溫度 為 38 ℃時膠束 的 載 藥量和粒徑均最好, 因此確定漩渦時間為 10min, 成膜溫度為38 ℃, 選取 DTX和 PEG-DSPE的質量比, 成膜時間,凍干時間和水化介質的體積四個因素進一步通過正交試驗設計進行處方優(yōu)化。

2.2.2 正交試驗 以制得多烯紫杉醇-M的粒徑分布15 ～25 nm粒徑范圍粒子所占百分比、 包封產率及載藥量為指標, 選擇多烯紫杉醇和 PEG-DSPE的質量比 (A), 成膜時間 (B), 凍干時間 (C) 及水化介質的體積 (D) 四個因素, 按照L9(34)正交設計表進行試驗。 正交試驗因素水平見表2。 正交試驗設計及結果見表3。 采用綜合評分法, 以載藥量和包封產率的最大值分別為 10 分, 粒徑分布100%為 10 分, 三項指標之和為綜合評分。 應用SPSS 軟件對評分實驗數據進行方差分析結果見表4。

圖 1 各因素對于多烯紫杉醇-M 粒徑及載藥量的影響 （n=3）Fig.1 Effects of different factors on the particle size and drug load of DTX-M （n=3）

表2 正交試驗的因素與水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal design

方差分析結果顯示,各因素作用主次為D＞A＞C＞B。 水化介質的體積 (D) 對于膠束粒徑,載藥量和包封產率有極顯著影響 (P＜0.01)。 多烯紫杉醇和 PEG-DSPE的質量比 (A) 及凍干時間(C) 對于膠束粒徑, 載藥量和包封產率也有顯著影響 (P＜0.05)。 而成膜時間 (B) 對于多烯紫杉醇-M的影響不大。 最終確定優(yōu)化水平組合應為A1B1C2D2, 即 多 烯 紫 杉 醇 和 PEG-DSPE的 質 量 比1 ∶15, 成膜時 間 30 min, 凍 干 時 間 12 h, 水 化 介質的體積2 m L。

表 3 正交實驗設計及結果 （n=3）Tab.3 Results of orthogonal design（ n=3）

表4 方差分析結果Tab.4 Results of analysis of variance

2.3 多烯紫杉醇-M的表征 按照優(yōu)化得到的處方和工藝, 制備 3 批多烯紫杉醇-M, 進行表征。

2.3.1 粒徑和表面電荷 采用 Zetasizer Nano粒度測定儀以動態(tài)光散射法測定制得膠束的粒徑和 Zeta電位。 測 定 條 件:10 mW He-Ne Laser(633 nm),散 射 角 度 為 90°,20℃。 測 得 其 平 均 粒 徑 為(18.3 ±1.8)nm, 粒度分布為 (73.3 ±7.1)%, Zeta電位為 (-17.20 ±6.46)mV。

2.3.2 包封產率和載藥量 取多烯紫杉醇-M溶液適量, 乙腈溶解后采用 HPLC測定膠束中 DTX的含量,以下式計算載藥量及包封產率。

色譜條件: 色譜柱 依 利 特 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)； 流動相乙腈-水 (50 ∶50), 體積流量1.0 mL/min； 檢 測 波長 230 nm； 柱 溫 30 ℃； 進 樣量 10 μL。 該 方法在 0.02 ～5 μg/m L質量濃度 范 圍內線 性 關 系 良 好, 線 性 方 程 為 A=22 416C+ 707.82(R2=0.999 8), 回 收 率 在 98.4% ～101.9%之間, 日內日間精密度 (n=5) 均 ＜2%,專屬性符合要求。 計算得到 DTX-M的包封產率為(54.4 ±0.08)%, 載藥量為 (3.6 ±0.5)%。

2.3.3 透射電鏡觀察 將多烯紫杉醇-M加水稀釋到適當濃度后滴到碳銅膜網上, 加3%磷鎢酸溶液負染,用濾紙吸干溶劑,置于透射電鏡下觀察形態(tài)并拍照, 結果見圖2。 可見多烯紫杉醇為形態(tài)均勻的球形粒子。

2.4 多烯紫杉醇-M的體外釋放試驗 采用透析法進行上述優(yōu)化后處方制備多烯紫杉醇-M的體外釋放研 究 。將 制 劑 分 散 于 pH 7.4 PBS 溶 液 中 至 多 烯紫杉醇質 量 濃度為 25 μg/mL, 取 1 mL置于截留分子量為12 000 的 透 析 袋 中 扎 緊, 另 取 1 mL, 加 入0.2 mL空 白 血 漿, 于截 留 分 子 量 為 12 000 的 透 析袋中扎 緊, 透 析 袋 分 別 放 置 在 100 mL含 0.1% W/V吐 溫 80(以 達 到 漏 槽 條 件)pH 7.4 PBS 溶 液中, 置于恒溫振蕩器 中 37 ℃,50 r/min 條件下孵育。 在設定時間點 (0.5、1、 2、 3、4、 6、 8、12 h) 取樣, 每次取出 2 mL, 并補充 2mL新鮮介質。平行操作 3 份。 用 HPLC測定不同時間釋放介質中多烯紫杉醇的含量,計算累計釋放百分率。多烯紫杉醇-M的體外釋放結果如圖 3 所示。

圖 2 多烯紫杉醇-M 透射電鏡照片Fig.2 TEM photograph of DTX-M

圖 3 多烯紫杉醇-M 的體外釋放曲線 （n=3）Fig.3 In vitro release profile of DTX-M （ n=3）

多烯紫杉醇-M在 PBS 緩沖液中約 4 h 釋放完全。 在血漿中多烯紫杉醇-M的釋放變緩, 約在8 h釋放完全,具有一定的緩釋效應。對多烯紫杉醇-M在 PBS 緩沖液和血漿中的釋放曲線進行模型擬合, 結果見表 5。 多烯紫杉醇-M在 PBS 緩沖液及血漿中的釋放均符合 Higuchi方程。

表 5 多烯紫杉醇-M 的釋藥模型擬合Tab.5 Fitting of releasemodel of DTX-M

4 討論

眾多抗腫瘤藥物,如紫杉醇、多烯紫杉醇以及阿霉素等在臨床應用中由于水溶性差而嚴重影響療效,提高這些藥物的水溶性已成為藥劑學研究的熱點。近年來,脂質體、微球、納米粒以及聚合物膠束等制劑 方 法 被 廣 泛 用 于 疏 水 性 藥 物 的 增 溶［8-10］。兩親性嵌段共聚物膠束作為藥物載體由于能夠實現增溶藥物、延長藥物半衰期以及增強腫瘤細胞的被動靶向性等優(yōu)勢而成為疏水性抗腫瘤藥物最有前景的給藥系統(tǒng)［11］。脂質核膠 束 是 由 脂 質 材 料 作 為 膠束內核的一種新型膠束,具有眾多優(yōu)點,比如核的疏水作用強,穩(wěn)定性好,對親脂性藥物的載藥量高, 適宜用作靜脈給藥［6］； 粒徑小,EPR效應和被動靶向作 用 強［5］； 臨 界 膠 束 濃 度 低, 體 內 給 藥后稀釋穩(wěn)定性好；制備材料合成簡單,易于規(guī)?；虡I(yè)化。因此本實驗嘗試制備多烯紫杉醇的脂質核膠束,以降低現有制劑的副作用,提高其抗腫瘤效果。

本實驗通過薄膜水化法成功制備了載難溶性抗腫瘤藥物多烯紫杉醇的脂質核膠束,膠束材料PEG-DSPE由親水性的 PEG鏈和親脂性的 DSPE鏈組成, 在有機溶劑揮發(fā)后, 形成透明的藥物-聚合物混合物基質,使藥物分子和聚合物鏈交纏在一起。 加入水化介質后,PEG鏈通過氫鍵與水分子結合,DSPE鏈段和親脂性的多烯紫杉醇遠離水溶液形成膠束的內核, 形成核-殼結構的膠束。 PEG鏈可以保護膠束系統(tǒng)和其中的藥物被機體免疫系統(tǒng)識別, 起到長循環(huán)的作用, 而成核的 DSPE, 可以被哺乳動物分泌的磷脂酶A2降解, 具有較好的生物可降 解 性［12］。此 外,PEG-DSPE的 臨 界 膠 束 濃度很低, 為 1 ×10-6mol/L［13］, 這使 其 在體內具有更好的穩(wěn)定性。

在正交試驗設計過程中選取粒徑分布,載藥量和包封產率3個指標通過綜合評分法進行評價處方的優(yōu)劣。這是考慮到三者對膠束的體內行為和抗腫瘤效果均有較大影響。膠束的粒徑分布直接影響到膠束通過 EPR效應富集于腫瘤組織的能力。 而載藥量越高,制劑的給藥劑量可以越小,安全性會越好。包封產率則關系到制劑過程中原料的損失也直接影響制劑的成本。這些都是制劑開發(fā)過程中需要考慮的因素。 試驗中我們發(fā)現, 隨著 20 nm左右膠束粒度分布的降低,載藥量有所升高,這可能是因為膠束中大粒子增多,而粒徑較大的粒子包載藥物較多所致。 文獻報道,10 ～20 nm的膠束能夠 最大程度滲透入并蓄 積 在 腫 瘤 組 織［14］, 粒 徑 較 大 粒 子載藥量雖高,但在體內腫瘤滲透效應較差,不利于膠束抗腫瘤作用的發(fā)揮,因此,在處方優(yōu)化的過程中,我們在考察載藥量的同時,還以粒度分布來控制大粒子的百分含量,使優(yōu)化后的膠束達到更好的體內抗腫瘤效果。 最終制得的膠束粒徑 70%以上在 20 nm左右, 有利 于提高 其體內的 EPR效應和抗腫瘤效果。

優(yōu)化后處方制得多烯紫杉醇脂質核膠束形態(tài)圓整, 粒 徑 較 小, 具 有 較 理 想 的 載 藥 量 (3.6 ± 0.5)%。 體外釋放試驗結果表明其具有一定的緩釋效應, 在 PBS 緩沖液和血漿中的釋放均符合Higuchi方 程。 多 烯 紫 杉 醇 血 漿 蛋 白 結 合 率 高( ＞90%) 可能是導致血漿中釋放減緩的原因之一［15］。后續(xù)試驗將進一步 進 行 該 制 劑 抗 腫 瘤 效 果的體內外評價。

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Preparation and characterization of docetaxel-loaded lipid-core m icelles

HU Kai-li, JIA Na, LIU Mei, FENG Jian-fang*

(Murad Research Center for Modermized Chinese Medicine,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai201203,China)

AIM To optimize the preparation of docetaxel-loaded PEG-DSPE lipid-coremicelles with orthogonal design and study the characteristics of the optimizedmicelles.METHODS The docetaxel-loaded PEG-DSPE lipid-coremicelleswere prepared by the thin-film hydration procedure using PEG-DSPE as the carriermaterial.The optimal formulation was verified by single factor experiment and orthogonal design.Themorphologic features of the micelleswere examined by transmission electron microscopy.The particle size and Zeta potential of the micelles were determined by dynamic light scatteringmethod.The docetaxel loads were detected by HPLC.The in vitro release property wasmeasured by dialysismethod.RESULTS The sphericalmicelleswere found to bewith a particle size of(18.3 ± 1.8)nm and a Zeta potential of(-17.20 ±6.46)mV.The drug loading capacity was 3.1% ～4.1%.The in vitro release results showed themicelles had a controlled release property,and the release profile was in line with the Higuchi equation.CONCLUSION The optimized docetaxel-loaded PEG-DSPE lipid-coremicelles,with ideal particle size,drug loading capacity and release properties,may improve the antitumor efficacy of docetaxel.

docetaxel； lipid-coremicelles； orthogonal design； in vitro release

R944.9

:A

:1001-1528(2014)06-1181-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.015

2013-10-15

上海市科學技術委員會納米專項項目 (11nm0506700)； 上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃 (shzy004)

胡凱莉 (1982—), 女, 副研究員, 博士, 主要從事納米及靶向給藥系統(tǒng)的研究。 Tel:(021)51322534,E-mail:Kaili-hu@ 163.com

*通信作者: 奉建 芳 (1966—), 博 士, 研 究 員, 從 事 中 藥 新 劑 型 與 新 制 劑 的 研 究。 Tel:(021)51322046； Fax:(021)51322531, E-mail:fengjianfang@vip.163.com