蔣烈浩 葛明華 凌志強 陸曉筱 胡思思

頭頸部腺樣囊性癌及癌旁組織中mir-21的表達

蔣烈浩 葛明華 凌志強 陸曉筱 胡思思

目的 通過檢測頭頸部腺樣囊性癌（HNACC）及癌旁組織中mir-21的相對表達量，分析其與HNACC臨床病理特征的關系。 方法 采用實時熒光定量PCR技術檢測36例HNACC組織和19例癌旁組織中mir-21的表達量。 結果 mir-21在ACC組織中的表達量明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；轉移復發(fā)組的mir-21表達量高于非轉移復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、神經(jīng)累及、骨累及以及不同TNM分期的mir-21的表達量的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。結論 mir-21的高表達與HNACC的發(fā)生、發(fā)展可能存在密切聯(lián)系，且在其復發(fā)和轉移中可能發(fā)揮著一定的作用。

頭頸腺樣囊性癌 微小RNA-21 實時熒光定量PCR

腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是頭頸腫瘤中較為常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于涎腺、淚腺、鼻咽等部位。這種腫瘤生長緩慢，但侵襲性較強，容易沿神經(jīng)和血管生長，且容易復發(fā)和轉移，故而預后常常較差[1]。到目前為止，該腫瘤高轉移和高復發(fā)的分子機制仍未十分明確。MicroRNA（miRNA）是一類長度為19～25nt的單鏈非編碼RNA，平均長度22nt，其主要通過與編碼蛋白靶mRNA的3′非編碼區(qū)結合，影響mRNA的穩(wěn)定性，導致其降解，或是抑制mRNA的翻譯，進而對基因進行轉錄后的調控。mir-21是miRNA家族中的重要成員，許多研究都表明，mir-21在人類多種腫瘤組織中存在高表達，其主要通過作用于多種靶基因，參與細胞增殖、分化、凋亡，與腫瘤生長、侵襲、轉移、耐藥等密切相關，是目前比較公認的致癌性的miRNA[2]。然而mir-21在頭頸ACC組織中的表達情況卻尚未見報道。我們通過實時熒光定量PCR技術對人頭頸ACC組織標本中mir-21的表達狀況進行了研究，并對mir-21的高表達的臨床意義作一探討。

1 材料和方法

1.1 材料 人頭頸ACC標本共36例，均取自外科手術切除的腫瘤組織，其中19例有相應的癌旁組織，17例只有癌組織，沒有對應的癌旁組織。36例癌組織及19例癌旁組織全部為外科手術切除后立即放入液氮罐中快速冷凍，其后保持在-80℃冰箱中備用。其中男16例，女20例；年齡35~74歲，中位年齡58歲；累及神經(jīng)的18例，未累及神經(jīng)的18例；累及骨組織9例，未累及骨組織的27例；復發(fā)或轉移的16例，未出現(xiàn)復發(fā)和轉移的20例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC，2010）：T1-3期17例，T4期19例。全部的標本均經(jīng)病理組織學切片證實為ACC組織和癌旁正常組織。本研究得到浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑儀器 NucleoSpin miRNA試劑（購自德國MACHEREY-NAGEL公司）；miRNA RT-PCR KIT（購自日本TAKARA公司）；SYBR Premix Ex Taq（perfect real time）試劑（購自日本TAKARA公司）；ABI 7500 PCR儀（購自Applied Biosystems公司）；S1000TMThermal cycler（購自美國BIO-RAD公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取及microRNA逆轉錄 從-80℃冰箱提取配對組織樣本，每例樣本取0.25~0.5g，放入超聲波細胞粉碎儀中粉碎，然后嚴格按照Nucleospin miRNA試劑盒說明書操作提取總RNA。取100ng總RNA，采用TAKARA公司的逆轉錄試劑盒（miRNA RT-PCR KIT）20μl體系進行逆轉錄，反應條件為37℃ 60min，85℃5S，逆轉錄完成后加入80μl無RNA酶水稀釋5倍。

1.3.2 PCR引物設計與實時熒光定量 實時熒光定量PCR使用U6做內參，引物序列如下：mir-21：5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3′，U6：5′-GAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。取上步驟逆轉錄稀釋產(chǎn)物2μl進行熒光定量PCR反應[SYBR Premix Ex Taq（perfect real time），TAKARA公司]，反應條件為50℃2min，預變性95℃30S，PCR反應95℃5s，60℃30s，40Reps，溶解曲線95℃15s，60℃1min，95℃15s。反應結束后導出數(shù)據(jù)，采用2－△△CT法分析mir-21的相對表達量。對于17例沒有對應癌旁的癌組織，我們將已有的19例癌旁組織的miRNA逆轉錄產(chǎn)物各取等分組成混合癌旁，作為其癌旁對照。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織mir-21表達量的比較 見圖1。

圖1 頭頸ACC與癌旁組織中mir-21相對表達量的比較

由圖1可見，癌組織和癌旁組織的mir-21的相對表達量分別為3.77±5.00和0.47±0.42，兩組間mir-21表達量的差異有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 不同臨床指標分組mir-21的表達量比較 見表1。

表1 不同臨床指標分組mir-21的表達量的比較

由表1可見，不同性別、年齡、TNM分期、神經(jīng)侵犯、骨累及的mir-21的表達量均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），而轉移和復發(fā)組較非轉移和復發(fā)組mir-21表達量明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

miRNA從1993年首次發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展成為一個具有1 600多個成員的大家族[3]。miRNA是長度為19~25nt的非編碼RNA，它與人類生命活動密切相關，miRNA其主要通過與編碼蛋白靶mRNA的3′非編碼區(qū)（3′UTR）結合，影響mRNA的穩(wěn)定性，導致其降解，或是抑制mRNA的翻譯，進而對基因進行轉錄后的調控。

miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著非常重要的作用，mir-21是目前比較公認的致癌性的miRNA，mir-21已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌和前列腺癌等多種實體瘤中存在高表達[4-7]。mir-21主要是通過調控靶基因發(fā)揮促腫瘤的作用，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和證實的靶基因有幾十種，其中大多數(shù)已經(jīng)被證實是直接調控的基因，如PDCD4抑制細胞生長，PTEN抑制細胞增殖和遷移等[8]。

Mir-21在腫瘤的篩查和診斷以及預后判斷方面也可能存在一定的價值，哺乳動物的血清血漿中存在MiRNA，且血清中MiRNA水平穩(wěn)定性高、重復性好，并且在同種生物的個體中的表達幾乎一致。Lawrie等[9]發(fā)現(xiàn)在彌漫性大B細胞瘤的患者的血清中mir-21的含量要明顯高于對照組，提示mir-21有可能成為彌漫性大B細胞瘤及可能更多的實體腫瘤非侵入性的診斷標志物。Yang等[10]甚至在對肺的非小細胞性肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)mir-21的高表達能夠降低患者的總體生存率，且mir-21和mir-155能夠預測腫瘤的復發(fā)和不良的預后。本實驗主要通過逆轉錄PCR和實時熒光定量PCR技術分析了頭頸ACC中癌組織與癌旁組織中mir-21的相對表達量，以及進一步分析各臨床指標與mir-21表達量的關系。結果顯示癌組織中mir-21的表達量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），腫瘤轉移和復發(fā)組mir-21的表達量高于非轉移和復發(fā)組（P＜0.05），這與Ferraro等[11]發(fā)現(xiàn)mir-21能促進腫瘤細胞上皮間質細胞轉換機制的結果在一定程度上是相符的。然而不同年齡、性別、神經(jīng)侵犯、骨累及和TNM分期組中的mir-21的表達量的差異均無統(tǒng)計學意義，考慮到本研究樣本量較少，頭頸ACC中mir-21表達量是否受年齡、性別、神經(jīng)侵犯、骨累及和TNM分期影響尚需進一步研究證實。

綜上所述，mir-21的高表達與頭頸ACC的發(fā)生、發(fā)展可能存在密切聯(lián)系，且在該腫瘤的復發(fā)和轉移中可能發(fā)揮著一定的作用。Mir-21將來可能成為改善頭頸ACC患者預后的一個有效的治療靶點。

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（本文編輯：沈昱平）

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Expression of mir-21 in adenoid cystic carcinoma of head and neck and its clinical significance

JIANG Liehao,GE Minghua,LING Zhiqiang，et al.Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China

Adenoid cystic carcinoma of head and neck MicroRNA-21 Real-time fluorescence quantitative PCR

2014-01-07）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺重點資助計劃（2012ZDA005）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程基金資助[浙衛(wèi)發(fā)2008（134）]

325035 溫州醫(yī)科大學（蔣烈浩、葛明華、陸曉筱、胡思思）；浙江省腫瘤醫(yī)院浙江省腫瘤研究所（凌志強）

葛明華，E-mail:gemingh@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of mir-21 in adenoid cystic carcinoma of head and neck(HNACC) and its clinical significance. Methods The expression of miR-21 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR in 36 samples of HNACC tissue and 19 samples of para-carcinoma tissue. Results The expression of mir-21 was significantly higher in HNACC tissues compared to para-carcinoma tissues(P＜0.01).The expression of mir-21 ofmetastasis and/or recurrence group significantly higher than non-metastasis and recurrence group(P＜0.05). Conclusion Results indicate that high expression of mir-21 may be related to the development of HNACC,and it may also be involved in the metastasis and recurrence of HNACC.